全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (12) : 1815 - 1818
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 05 - 22; 修回日期 : 2008 - 11 - 03
基金项目 : 江苏省农业科技自主创新基金项目 [ CX (08) 121 ]; 江苏省高技术研究计划项目 (BG2007302)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yjzhou@ jaas1ac1cn)
江苏省番茄黄化曲叶病的病原分子诊断
季英华1 , 熊如意1 , 程兆榜1 , 周　彤1 , 赵统敏2 , 余文贵2 , 范永坚1 , 周益军13
(1江苏省农业科学院植物保护研究所 , 南京 210014; 2 江苏省农业科学院蔬菜研究所 , 南京 210014)
摘 　要 : 2007年冬季在江苏省兴化市和南京市一些日光温室大棚中发生了一种新的番茄病毒病 , 主要
表现为植株矮缩 , 叶片上卷 , 叶缘黄化等 , 危害十分严重。为明确其病原 , 对田间表现典型症状的 20份病
样进行了分子检测 , 结果全部检测到粉虱传双生病毒 ; 对其中 12份进行序列同源性分析 , 发现其同源性超
过 98% , 说明其极可能是同一个分离物 ; 将该序列与 GenBank进行 BLAST分析 , 发现其与番茄黄化曲叶病
毒的同源性最高 , 达 99%。
关键词 : 番茄 ; 番茄黄化曲叶病 ; 粉虱传双生病毒 ; 分子诊断
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1221815204
M olecular D iagnosis of Toma to Y ellow L eaf Curl D isea se in J iangsu Prov ince
J I Ying2hua1 , X IONG Ru2yi1 , CHENG Zhao2bang1 , ZHOU Tong1 , ZHAO Tong2m in2 , YU W en2gui2 , FAN
Yong2jian1 , and ZHOU Yi2jun13
(1 Institu te of P lant P rotection, J iangsu A cadem y of A gricu ltura l Sciences, N an jing 210014, Ch ina; 2 Institu te of V egetable C rops,
J iangsu A cadem y of A gricu ltura l Sciences, N an jing 210014, Ch ina)
Abstract: In winter of 2007, a new virus disease on tomato broke out in J iangsu and caused great losses
to local tomato p roduction. The infected tomato showed severely stunted, upward curling and p rom inent yello2
wing along margins and interveinal regions. Based on its symp tom s and the occurrence of B em isia tabaci in the
fields, whitefly2transm itted gem inivirus (W TG) was suspected to be the pathogen, and W TG was identified in
all the 20 samp les. The nucleotide sequence identities between these isolates were extremely high ( over
98% ) , which means no comp lex infection was found. The result of BLAST revealed they shared high se2
quence identities (over 99% ) with a member of B egom ovirus: Tomato yellow leaf curl virus ( TYLCV ).
Key words: tomato; tomato yellow leaf curl disease; whitefly2transm itted gem inivirus; molecular diag2
nosis
双生病毒是一类具有双联体结构的植物单链环状 DNA病毒 , 包括 4个属 , 200多个种 ( Fauquet
et al. , 2005) , 其中对作物造成危害的大多属于菜豆金色花叶病毒属 (B egom ovirus) , 其传播介体为
烟粉虱 (B em isia tabaci) , 也称为粉虱传双生病毒 (whitefly2transm itted gem inivirus, W TG)。目前此类
病害在亚洲、美洲中部、欧洲、南非中北部及地中海等地区广泛分布和流行 (Moriones & Navas2Ca2
stillo, 2000; Morales & Anderson, 2001; Crescenzi et al. , 2004) , 据初步统计 , 至少已有 39个国家的
棉花、木薯、番茄等作物遭受此类病毒毁灭性的危害 (Moffat, 1999)。
在我国 , 龚祖陨等 (1982) 通过电镜观察到烟草曲叶病毒孪生粒体 , 证实了双生病毒在国内的
发生。20世纪 90年代后 , 该类病毒在我国台湾、广西、云南、海南、广东、福建等地发生 , 对番
茄、烟草、番木瓜等作物造成了严重的危害 (刘玉乐 等 , 1998; Zhou et al. , 2001; W ang et al. ,
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2004; Xiong et al. , 2005; Mugiira, 2007)。2006年底与江苏毗邻的上海和浙江两地此类病害爆发成灾
(王东生 等 , 2006; 张穗 等 , 2006; 吴永汉 等 , 2007; 张纯胄 , 2007; Mugiira et al. , 2008) , 致使
当地的番茄生产蒙受了惨重的损失。
2007年 11月江苏省部分地区一些番茄日光温室也发生了一种新的病害 , 症状表现极似双生病毒
病。该病在部分地区已造成严重的危害。笔者对江苏省兴化市和南京市保护地番茄上采集的 20份疑
似病样进行了分子诊断 , 从中均检测到粉虱传双生病毒。
1　材料与方法
20份番茄病样于 2007年冬季采自江苏省兴化市昭阳镇、南京市江宁区和玄武区日光温室大棚。
根据双生病毒共同区及外壳蛋白基因保守序列设计简并引物 PA /PB (Deng et al. , 1994)。
　 　 PA: 5′2TAATATTACCKGW KGVCCSC23′,
PB: 5′2TGGACYTTRCAWJJBCCGCACA23′, 由 上
海英骏生物技术有限公司合成。
采用 CTAB 法提取病样总 DNA ( Harrison et
al. , 1997)。PCR反应条件 : 94 ℃预变性 2 m in;
94 ℃ 45 s, 53 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 m in; 35个循环 ;
72 ℃继续延伸 10 m in。反应完毕后于 1%琼脂糖
凝胶电泳中检测扩增产物。
从 20份样品中选取 12个有代表性的分离物
对其 PCR产物进行序列测定 , 详细信息如表 1。
测序由上海生工生物工程技术服务有限公司
完成。采用 DNA star软件及 NCB I网站上的 BLAST
程序进行比对分析。
表 1　测序样品信息
Table 1　 Informa tion of 12 isola tes sequenced
采样地点
Samp ling p lace
采样时间
Samp ling time
编号
No.
分离物
Isolation
南京市玄武区 2007 - 12 - 18 1 JS2NJ2JAAS1
Xuanwu, Nanjing 2 JS2NJ2JAAS2
3 JS2NJ2JAAS3
4 JS2NJ2JAAS4
南京市江宁区 2007 - 12 - 07 5 JS2NJ2JN1
J iangning, Nanjing 6 JS2NJ2JN2
7 JS2NJ2JN3
8 JS2NJ2JN4
兴化市昭阳镇 2007 - 11 - 19 9 JS2XH1
Shaoyang, Xinghua 10 JS2XH2
11 JS2XH3
12 JS2XH4
2　结果与分析
211　田间病株症状
20份病样均表现为植株矮化 , 叶片上卷 , 变小 , 叶缘黄化 , 症状类似于番茄黄化曲叶病 (图 1)。
图 1　病样的田间症状
A: 对照 ; B: 病株。
F ig. 1　Sym ptom s of the v irus2infected toma to com pared w ith hea lthy plan t
A: Healthy p lant; B: V irus2infected p lant.
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　12期 季英华等 : 江苏省番茄黄化曲叶病的病原分子诊断 　
212　PCR检测
20份样品抽提 DNA后 , 根据双生病毒基因间隔区和外壳蛋白保守序列设计的 PA /PB引物进行分
子检测 (以采自上海确认含有粉虱传双生病毒的番茄病样作为阳性对照 , 以健康番茄样品作为阴性
对照 ) , 结果全部检测到 500 bp左右的目的条带 , 初步证明其中都含有粉虱传双生病毒。
图 2　PCR检测结果
M: Marker; + : 阳性对照 ; - : 阴性对照 ; 1～20: 番茄病样。
F ig. 2　Results of PCR
M: Marker; + : Positive control; - : Negative control; 1 - 20: Samp les from J iangsu.
213　序列分析
将 12个分离物的序列进行同源性分析 , 发现其同源性非常高 , 高于 98% , 说明其极有可能是一
个分离物。将序列与 GenBank进行 BLAST分析 , 显示序列与番茄黄化曲叶病毒 ( EF523478) 的同源
性最高 , 超过 99% , 从而初步证明作者所检测到的是番茄黄化曲叶病毒。
表 2　12个样品序列之间的同源性
Table 2　Percen tage of sim ilar ity of 12 sam ples
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 3 3 3 9915 9913 9913 9918 9915 100 100 100 100 9918 100
2 3 3 3 9819 9913 9913 9911 9915 9915 9915 9915 9913 9915
3 3 3 3 9816 9911 9911 9913 9913 9913 9913 9911 9913
4 3 3 3 9911 9819 9913 9913 9913 9913 9911 9913
5 3 3 3 9913 9918 9918 9918 9918 9915 9918
6 3 3 3 9915 9915 9915 9915 9913 9915
7 3 3 3 100 100 100 9918 100
8 3 3 3 100 100 9918 100
9 3 3 3 100 9918 100
10 3 3 3 9918 100
11 3 3 3 9918
12 3 3 3
番茄黄化曲叶病毒 ( tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 属双生病毒科 ( Gem iniviridae) 中的菜
豆金色花叶病毒属 , 传播介体为烟粉虱 , 能在番茄上造成毁灭性危害。该病毒自 1964年报道以来
(Cohen & Harpaz, 1964) , 许多国家和我国的许多地区都已有相关报道。2007年底该病毒在江苏省首
次被检测到 , 并且在局部地区已造成了较严重的危害。鉴于此类病毒扩散蔓延非常迅速 , 危害异常严
重 , 生产上应当密切关注其发生危害情况 , 及时发现 , 尽早防治。
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