全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 1093～1095
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 10 - 19; 修回日期 : 2006 - 01 - 23
基金项目 : 山东省自然科学基金资助项目 ( Y2004D02) ; 吉林农业大学科研基金资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: qiweihe1215@ yahao1com1cn; zdyu@ sohu1com)
TuM V2Nib反义基因对大白菜的遗传转化研究
于占东 1, 2 　赵双宜 3 　何启伟 13 　王翠花 1 　牟晋华 1 　刘春香 1 　康　静 2
(1 山东省农业科学院蔬菜研究所 , 山东济南 250100; 2 吉林农业大学园艺学院 , 吉林长春 130118; 3 山东大学生命科
学院 , 山东济南 250100)
摘 　要 : 以 ‘福山包头 ’大白菜子叶为试材 , 以 Anti2TuMV2N ib为目的基因 , 利用根癌农杆菌介导法 ,
建立了大白菜再生转化体系 , 获得转化植株。经 PCR2Southern杂交、RT2PCR及 EL ISA 检测 , 证明外源
TuMV2N ib基因已整合到大白菜核基因组中并获得了表达。
关键词 : 大白菜 ; 芜菁花叶病毒 ; 复制酶基因 ; 遗传转化
中图分类号 : S 63411　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521093203
Genetic Transforma tion of Anti2TuM V2N ib into Transgen ic Ch inese Cabbages
Yu Zhandong1, 2 , Zhao Shuangyi3 , He Q iwei13 , W ang Cuihua1 , Mou J inhua1 , L iu Chunxiang1 , and Kang J ing2
(1 Institu te of V egetable C rops, Shandong A cadem y of A gricultural Sciences, J ipinan, Shandong 250100, China; 2 College of Horti2
cu lture, J ilin A gricultural U niversity, Changchun, J ilin 130118, China; 3 College of L ife Sciences, Shandong U niversity, J ipinan,
Shandong 250100, Ch ina)
Abstract: A grobacterium tum iefaciens2mediated regeneration system was established using Anti2TuMV2
N ib gene. Cotyledons with petiole from asep tic seedlings of Chinese cabbage (B rassica cam pestris ssp. pek in2
ensis‘Fushanbaotou’) were used as exp lants and the transgenic p lants were obtained. The analysis of PCR2
Southern blotting, RT2PCR and EL ISA detection showed that the target gene was integrated into the Chinese
cabbage genome and exp ressed.
Key words: Chinese cabbage; TuMV; N ib gene; Genetic transformation
1　目的、材料与方法
芜菁花叶病毒 ( Tu rn ip m osa ic virus) 可以侵染白菜、油菜等十字花科作物 , 并有多种株系的分
化。该病毒为 10 kb的单链正义 RNA , 孔令洁等已分离出 TuMV2cp基因〔1〕。目前已将 TuMV2cp基因
导入油菜和白菜〔2, 3〕。但在大白菜遗传转化中存在转化频率低 , 重演性差及基因型限制等问题。作者
以 TuMV2N ib基因转化高感 TuMV的 ‘福山包头 ’大白菜 , 研究影响其再生转化的因素 , 获得了抗病
毒植株。
试材有福山包头 (高感 TuMV2C4 )、石特 7923、992682、2001295自交系。取播种 5～6 d的大白
菜子叶柄为外植体 , 在含不同浓度 62BA的 MS培养基上进行诱导培养 , 培养温度 (25 ±1) ℃, 光照
2 500 lx, 16 h·d - 1。从接种 TuMV2C4 病毒的大白菜叶片中提取总 RNA〔4〕, 用 RT2PCR法得到 111 kb
N ib片段 , 将其反向插入 pROK2的 35S启动子后构成 pRTuB反义表达载体。利用农杆菌介导法 , 进行
卡那霉素 ( Kan) 和羧苄青霉素 (Cb) 的选择培养。采用 CTAB法提取转化株基因组 DNA , 用 PCR2
Southern检测 TuMV2N ib基因是否在大白菜基因组中整合。以 TuMV基因序列设计一对 PCR引物 , P1 :
5piTCTGCGAGGTTATGG 3pi, P2 : 5piGCTTTCCCTTCTTGT3pi。采用 D iG DNA Labeling and Detection Kit标记
TuMV2N ib基因的探针 ; 电泳、印迹及杂交按文献 〔5〕的方法进行。提取对照及转基因大白菜的总
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
RNA , 以其为模板进行 RT2PCR。同时以 actin基因作为内参对照 , 检查各处理基因表达的一致性。参
照文献 〔3〕的双抗体夹心法 , 进行 EL ISA检测转化株中 TuMV的含量。
2　结果与讨论
211　大白菜再生转化体系的建立
将大白菜子叶柄在 MS + 2 mg·L - 1 62BA + 015 mg·L - 1 NAA + 4 mg·L - 1 AgNO3 , 蔗糖 310% , 琼
脂 110%分化培养基上培养 , 不同基因型间不定芽的再生频率存在很大差异 , 其中福山包头再生频率
较高。
利用农杆菌介导法 , 将 TuMV2N ib反义基因导入大白菜福山包头 , 结果表明大白菜子叶以农杆菌
浸染 5～10 m in, 菌液浓度 OD600为 016～018, 共培养时间在 60～72 h, 可获得较高的转化频率。经过
共培养的子叶柄转至含 500μg·mL - 1羧苄青霉素及 10μg·mL - 1 Kan的筛选培养基中 , 20～21 d后 ,
大量外植体出现白色和浅绿色的不定芽在筛选中逐渐死亡 , 只有极少量子叶柄基部切口处逐渐长出小
芽。在选择培养基中进行筛选得到 39株绿苗 , 转化率为 711% , 转移到含有 10μg·mL - 1卡那霉素的
生根培养基中诱导生根 , 35株发育成为形态正常的小植株。
212　TuM V2N ib基因在大白菜中的整合与表达
对福山包头大白菜转化株的基因组 DNA进行 PCR扩增 , 有 14株扩增出 111 kb的 DNA片段 , 部
分转化植株的 PCR2Southern blot杂交结果见图 1, 初步证明这些植株中确实整合了 TuMV2N ib基因。
图 1　福山包头 T0 代转基因植株 PCR2Southern杂交结果
M: λDNA /EcoRⅠ + H ind Ⅲ; P: 质粒 DNA扩增片段 (111 kb) ; 1～8: 转基因植株 ; - : 非转基因植株 (对照 )。
F ig. 1　Results of PCR2Southern hybr id iza tion of T0 tran sgen ic plan ts in Ch inese cabbage
M: Marker; P: Plasm ids; 1 - 8: Transgenic p lants; - : Control.
图 2　T0 转基因大白菜和对照基因 actin的 RT2PCR扩增结果
M: λ2ECOT14 ID igest; + : 阳性对照 ; - : 阴性对照 ; 1～5: T0 代福山包头。
F ig. 2　RT2PCR of tran sgen ic Ch inese cabbage and am plif ica tion of the actin con trol gene
M: λ2ECOT14 ID igest; + : Positive control; - : Negetive control; 1 - 5: T0 generation of‘Fushanbaotou’.从部分 T0 代转基因植株 RT2PCR鉴定结果可看出 , T0 代在接种及未接病毒时均产生 1条 111 kb的TuMV2N ib带 , 而对照仅在 TuMV感染时产生该条带 , T0 代在 TuMV感染时 TuMV2N ib并未大量合成(图 2)。该结果进一步证明 , 转基因大白菜中不仅整合了 N ib基因 , 而且获得了表达 , 并很有效地抑制
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　5期 于占东等 : TuMV2N ib反义基因对大白菜的遗传转化研究 　
了 TuMV的复制。actin内参对照 RT2PCR结果表明 , 在不同株系间的基因表达程度一致 (图 2)。
213　T0 代转基因大白菜对 TuM V的抗性
上述 PCR阳性植株先后两次接种 TuMV2C4 株系 , 经过近 50 d的观察 , 发现转基因植株中有 2株
一个月后轻度发病 , 另外 12株均无明显发病症状 , 而未转化的植物在 20 d后就表现出明显花叶并逐
渐变为畸形 (图 3)。
图 3　T0 代转基因植株对 TuM V2C4 的抗病反应
F ig. 3　Respon se of than sgen ic plan ts after incula tion w ith TuM V2C4
　　从 EL ISA检测结果可以看出 , 转基因植株体
内病毒含量明显低于非转化植株 (表 1)。不同转
基因植株间 TuMV的积累量存在一定的差异 , 但
均表现出明显的抗病毒侵染能力。表明 TuMV2N ib
基因表达后可有效抑制受体内 TuMV的复制。
214　T1 代转基因植株的 PCR检测
为了获得转基因大白菜纯合系 , 取 T0 代单拷
贝 TuMV2N ib基因插入的福山包头 (即 FsT0 26 )
株系自交 , 进行 PCR检测。结果在 R1 ( FsT0 62T1 表 1　转基因植株抗 TuM V2C4 EL ISA检测Table 1　EL ISA a ssay of tran sgen ic plan ts to TuM V2C4 resistance编号 No. OD490 编号 No. OD49018AT0 21 01122 18AT0 223 0111218AT0 24 01108 18AT0 225 0109718AT0 26 01118 18AT0 229 0109618AT0 29 01115 18AT0 241 0111418AT0 212 01104 18AT0 243 0111018AT0 218 01123 18 (CK - ) 0109118AT0 221 01134 18 (CK + ) 01405
株系 ) 代的 31株转基因植株中有 23株表现出阳性。初步证明整合到大白菜基因组中的目的基因已经
遗传至 T1 代 , 遗传分离比例符合 3∶1孟德尔遗传规律 , 为 1对基因控制的显性遗传。目前转基因后
代材料已种植在田间 , 进行其它农艺性状的观察及抗病毒转基因纯合系的选育。
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