全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 644 - 648
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 11 - 18; 修回日期 : 2007 - 02 - 28
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (399770521, 39200079) ; 国家 ‘863’项目 (2001AA21221)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zbye@mail1hzau1edu1cn)
不同结构的外源 ACO 基因导入番茄对乙烯生成速
率的影响
陈银华 1, 3 , 李汉霞 2 , 叶志彪 1, 23
(1 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 武汉 430070; 2华中农业大学国家蔬菜中心华中分中心 , 武汉
430070; 3 教育部热带海洋与陆生生物资源研究及利用重点实验室 , 海口 570228)
摘 　要 : 为研究不同结构的外源基因对内源基因的影响 , 通过农杆菌介导的遗传转化法将 3种不同结
构的外源 ACO基因导入番茄基因组中 , 对 3种不同载体转基因植株的乙烯生成情况进行了检测。结果表
明 , 3种载体中 , RNA i对内源 ACO基因表达抑制作用最明显。
关键词 : 番茄 ; ACO基因 ; RNA i; 乙烯释放量
中图分类号 : S 64211　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320644205
Effects of In troduction of D ifferen t T2D NA Structures of ACO Gene to Toma2
to Genom e on Ethylene Production Ra te
CHEN Yin2hua1, 3 , L I Han2xia2 , and YE Zhi2biao1, 23
〔1N ational Key Laboratory of C rop Genetic Im provem ent, Huazhong A gricu ltura l U niversity, W uhan 430070, Ch ina; 2N ational
Cen ter for V egetable Im provem ent (Central China) , Huazhong A gricu ltura l U niversity, W uhan 430070, China; 3 Key L aborotory
for Tropica l B iological Resources, M inistry of Education, Haikou 570228, Ch ina〕
Abstract: To analyze the effect of different structures of foreign genes on the endogenous genes, three
different T2DNA structures of ACO gene were introduced into tomato genome through the method of A grobac2
tu rium 2mediated transformation. The ethylene evolution of the transgenic tomato p lants was measured by gas
chromatography. The results showed that in the three different transgenic p lants the maximum inhibition of en2
dogenous ACO gene exp ression was observed using RNA i vectors.
Key words: Tomato; ACO gene; RNA i; Ethylene evolution
利用分子生物技术克隆植物乙烯 ACS (ACC合成酶 ) 和 ACO (ACC氧化酶 ) 基因 , 通过反馈调
节、反义表达等调控乙烯合成 , 进而调控乙烯对植物的生理效应 , 是当前乙烯作用研究的重要内容。
国内关于利用反义 RNA技术调节乙烯合成量的研究已在番茄等一些跃变型果实中获得成功 (叶志彪
和李汉霞 , 1996)。Picton等应用反义 RNA技术转移 ACC氧化酶基因 , 转基因番茄植株果实乙烯生
成量比对照组下降了 90% , 而将 ACC氧化酶基因反义导入芥菜 , 转基因组织在组培 7 d后乙烯产量
比对照组降低 64% ～83% , 第一代转基因植株组织与亲本植株相似 , 乙烯和 ACC氧化酶活性下降了
50% ～75% ( Pua & Lee, 1995; Savin et al. , 1995)。此外 , 利用 ACC氧化酶基因的反义 RNA技术
抑制康乃馨乙烯释放从而延缓花瓣的衰老也取得成功 (Ma & Song, 1997)。至今已获得转反义 ACC
合酶基因或反义 ACC氧化酶基因的植物还有 : 香石竹、白芥属植物、烟草、甜瓜、马铃薯、百合、
满天星、猕猴桃和枣树 (Lasserre et al. , 1996; Guis et al. , 1997; Cushman, 1998; Gallie, 1998)。
RNA干扰 (RNA interference, RNA i) 是最近几年发现和发展起来的一门新兴的转录水平上的基
　3期 陈银华等 : 不同结构的外源 ACO基因导入番茄对乙烯生成速率的影响 　
因阻断技术 , 是一种序列特异性的转录后基因沉默 (post2transcrip tional gene silencing, PTGS)。它可
能是生物体的一种进化保守机制 , 同时也可能成为特异性沉默内源基因和基因功能分析的一个新工具
( Fire et al. , 1998; Fraser et al. , 2000; Sm ith et al. , 2000)。
本研究利用番茄 ACO基因 , 构建正义、反义、RNA i载体进行番茄的遗传转化研究 , 分析 3种不
同载体对内源基因表达抑制作用差异 , 为进一步利用反义技术鉴定基因功能和创建特异突变体提供理
论指导和实践依据。
1　材料与方法
供试番茄品种 ‘中蔬 5号 ’种子来自于中国农业科学院 ; 根癌农杆菌 (A grobacterium tum efa2
ciens) 菌株 LBA4404分别携带 pLBE、pABE、pD311质粒 , 这些质粒分别含有番茄 ACO基因的正义、
反义、RNA i 3种 T2DNA结构 (图 1)。其中 ACO基因为根据电子克隆序列设计引物 , 从病原诱导的
番茄幼苗叶片中扩增的全长 cDNA序列 , 长度为 1 000 bp。
图 1　含 ACO 基因 3种植物表达载体 T2D NA区段结构图
F ig. 1　The T2D NA structure of the three expression vectors w ith ACO gene
番茄的遗传转化操作参照 Ouyang等 (2003) 的方法。提取卡那霉素抗性植株及阴性对照的总
DNA, 进行 PCR 检测。 PCR 引物为 N PT Ⅱ2F: 5′2AGACAATCGGCTGCTCTGAT23′和 N PT Ⅱ2R: 5′2
TCATTTCGAACCCC AGAGTC23′。对 PCR阳性植株进一步用不同的酶与探针组合进行 Southern杂交检
测 ( Sambrook et al. , 1989)。其中 N PTⅡ探针扩增与 PCR检测引物一致 , 35S的引物为 , P35 s2F: 5′2
AGGCTTACGCAGCAGGTCTCAT23′; P35 s2R: 5′2GGAAGGGTCTTGCGAAGGATAG23′。
转基因番茄植株的乙烯生成速率检测 : 于初花期选择单拷贝转化植株 5株混合取样 , 取植株中部
功能叶片 10～15 g, 剪成 1 cm ×1 cm大小的碎片 , 置于医用葡萄糖瓶中 , 橡皮塞封口 , 每瓶为 1个
重复 , 设置 3个重复。每隔 015 h或 1 h测定乙烯浓度 , 每个重复测 3次 , 重新封口 , 连续测定 6 h
(叶志彪和李汉霞 , 1996)。
2　结果与分析
211　转基因番茄植株的获得及其分子鉴定
为研究 ACO基因的表达调控 , 用构建的 3个载体进行遗传转化。
农杆菌浸染的子叶外植体 , 经选择培养基筛选后 , 大多数子叶颜色变暗 , 叶片萎蔫并最终在继代
培养中死去 ; 只有少数子叶的基部能逐渐长出少量致密的愈伤组织并慢慢转为绿色 , 大约 3～4周后
便能分化形成小芽点 , 转入玉米素 ( ZT) 浓度为 110 mg·L - 1的选择性芽分化培养上 , 小芽点逐渐分
化出幼叶 , 形成小芽。将带有正常顶芽的愈伤组织转入到 012 mg·L - 1 ZT培养基上 , 当芽长到 3 cm
时切下 , 转入生根培养基生根。再生植株在室内炼苗一周后 , 进行大田栽培管理。
提取 3个载体转化所获得的 60株卡那霉素抗性植株基因组 DNA , 以未转化植株 ( ZS5) 为阴性
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对照 , 质粒为阳性对照 , 利用 N PTⅡ引物进行 PCR扩增。110 %琼脂糖凝胶检测扩增产物 , 发现质
粒及其中的 48株转基因植株都能扩增出预期大小 740 bp的电泳条带 , 而在未转化对照中则未出现该
特异带 , 初步推断这些植株中含有外源基因片段。
以不同的酶与探针组合对 48株 PCR阳性植株进行了 Southern杂交分析。
图 2为 KpnⅠ / N PTⅡ组合对 pLBE转基因番茄植株的 Southern杂交结果。未转基因对照 ZS5没有
杂交信号。全部 21株转基因样品中 , 10株有杂交信号 , 杂交的阳性率为 4716% , 进一步表明外源片
段已整合到这些植株的基因组中。不同的转基因单株中外源基因整合的拷贝数有明显差异 , 有单拷贝
和多拷贝 , 单拷贝植株分别编号为 L2、L14、L16、L21。
图 2　pL BE转基因植株的 Southern杂交分析 ( KpnⅠ / N PTⅡ)
1～21: 转基因植株 ; CK: 中蔬 5号。
F ig. 2　Southern blot ana lysis of pL BE tram sgen ic plan ts ( KpnⅠ / N PTⅡ)
1 - 21: Transgenic p lants; CK: Zhongshu 5.
图 3为 SacⅠ酶切 pABE转基因番茄植株 DNA样品 35S探针杂交的结果 , 对照没有杂交信号。调
查的 19株转基因材料中有 11株出现了杂交信号。杂交阳性率为 5718%。检测的转基因植株中 , 多
为 1～2个拷贝 , 多拷贝 (3个以上 ) 的只出现了 1株。其中的单拷贝编号为 E2、E4、E9、E11; 2
个拷贝的编号为 E5、E16、E17。
图 3　pABE转基因植株的 Southern杂交分析 ( SacⅠ /35S)
1～19: 转基因植株 ; CK: 中蔬 5号。
F ig. 3　Southern ana lysis of pABE tran sgen ic plan ts ( SacⅠ /35S)
1 - 19: Transgenic p lants; CK: Zhongshu 5.
图 4为 Kpn I/ Intron组合对 pD311转化植株的杂交结果。在检测的 8株 PCR阳性植株中有 6株有
杂交带 , 阳性率为 75%。其中编号 D1、D3、D5单株为单拷贝插入。
212　转基因植株叶片乙烯生成速率分析
取转基因单株 L2、L14 (pLBE) ; E4、E5 (pABE) ; D5 (pD311) 的叶片 , 测定乙烯生成速率
的变化 (图 5)。
从叶片切割受伤诱导乙烯生成速率来看 , 未转基因对照植株叶片有典型的乙烯跃变曲线 , 所测定
的转基因植株中 , 除 D5外 , 4个单株的乙烯生成速率的变化曲线与对照一致。D5单株在受伤后 3 h
内 , 乙烯生成速率最少 , 没有明显的曲线变化 , 表明该单株叶片没有诱导乙烯形成 , 推测是由于
ACO基因的发卡结构导入基因组所引起。L14单株乙烯生成速率大于对照 , 推测由于导入的正义 ACO
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　3期 陈银华等 : 不同结构的外源 ACO基因导入番茄对乙烯生成速率的影响 　
基因在番茄植株中过量表达所致。而 L2单株在乙烯释放高峰时的量甚至比反义载体转化植株更低 ,
推测由于同源抑制现象的存在导致内源基因表达量降低所致。这种同一载体转基因植株中外源基因作
用的差异是否由于插入位点的差异所致 , 值得进一步研究。E4、E5单株乙烯生成速率都有一定程度
的降低 , 说明外源基因起到了一定作用 , 但这种抑制或是促进作用并不明显。
图 4　pD311转基因植株的 Southern杂交分析 ( KpnⅠ / In tron)
1～8: 转基因植株 ; CK: 中蔬 5号。
F ig. 4　Southern ana lysis of pD311 tran sgen ic
plan ts ( KpnⅠ / In tron)
1 - 8: Transgenic p lants; CK: Zhongshu 5.
图 5　转基因植株叶片受伤后乙烯生成速率分析
F ig. 5　Ana lysis of ethylene production ra te in
wounded2leaves of tran sgen ic toma toe
　　由于转基因植株中外源基因多以杂合体的形式存在 , 对外源基因在转基因植株中的作用需要纯合
株系进一步分析 , 本试验的结果只能进行初步比较。
3　讨论
内源基因的表达调控有多种方式。反义基因技术是应用较多也较清楚的一种方式 , 但该技术存在
区段效应、剂量效应。Delauney用完整的 CAT基因或用 5′端 172 bp区段的反义载体转化烟草时 , 完
整的反义基因转化植株有 9株被部分抑制 (40% ) , 6株为完全抑制 ; 用 5′端区段的反义载体转化的
18株有 10株 CAT表达受阻减弱 , 但没有一株被完全抑制 ( Peach & Velten, 1991)。Saundler发现在
全长的 1 565 bp的 N os基因中 , 第 261～900 bp区段比其它区段对 Nos的表达抑制更为有效。Ham il2
ton用分离出来的 TOM13 cDNA构建了反义基因载体 , 在所获得的转基因植株中 , 乙烯释放受到抑
制 , 转基因自交后代分别带有 0、1和 2个反义基因 , 含有两个反义基因的后代乙烯释放受抑的程度
大于含有 1个反义基因的植株 ( Ham ilton et al. , 1990)。本研究构建了 E11全长 cDNA的正义、反
义、RNA i表达载体 , 进行转基因研究。反义基因转化植株的乙烯释放量都有下降 , 但这种作用与对
照相比并没有显著差异 , 不能引起乙烯生成曲线的变化。说明在利用反义技术抑制内源基因表达时 ,
确实要考虑多方面的因素。
本研究中反义基因对内源基因抑制作用的低效率是由于剂量效应、位点效应 , 还是区段效应 , 有
待于进一步研究。
依据同源依赖性原理 , 导入正义基因同样能引起内源基因的表达抑制 ( Gallie, 1998)。Han和
Grierson (2002) 报道 , 反义 ACO基因导入番茄后比正义 ACO 基因更能抑制内源 ACO 基因的表达。
但从本研究的结果来看 , 正义基因导入番茄基因组中既能抑制内源基因的表达 , 也能促进其表达 , 抑
制效果比反义基因的好。但与对照相比 , 无论抑制还是促进 , 其差异都不显著。
RNA i具有很高的特异性 , 能够非常特异地只降解与之序列相应的内源基因的 mRNA。RNA i抑制
基因表达具有很高的效率 , 表型可以达到缺失突变体表型的程度。而且相对少量的双链 RNA分子就
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能完全抑制相应基因的表达。关于利用 RNA i技术抑制内源表达 , 曾在花椰菜上取得完全抑制内源表
达的转化植株 (陈银华 等 , 2005)。本研究获得的 RNA i转化株 , 其乙烯生成也受到明显抑制。对比
3种不同的载体而言 , RNA i转化株的抑制效率明显高于其他两种。
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