全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (12) : 1803 - 1808
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 07 - 03; 修回日期 : 2008 - 10 - 17
基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (2006BAD22B01) ; 重庆市柑橘重大专项 (CSTC, 2007AA1018)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhengguoli@ cqu1edu1cn)
脐橙 Cs NAC基因的克隆及其在果实贮藏过程中的
表达分析
樊　晶 , 李正国 3 , 高　雪 , 杨迎伍 , 邓　伟
(重庆大学生物工程学院基因工程研究中心 , 重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室 , 重庆 400044)
摘 　要 : 从脐橙 (C itrus sinensis O sbeck) 果皮褐变相关基因的 cDNA抑制差减文库中 , 筛选了一个与
NAC基因家族同源的 EST序列 , 通过 RACE技术成功克隆了 CsNAC基因全长 cDNA序列共 1 203 bp, 并对
其进行了序列分析。结果表明 , CsNAC包含一个 918 bp的开放阅读框 (ORF) , 编码 305个氨基酸 , 预测
的蛋白质分子量为 3512 kD, 等电点为 6172; CsNAC蛋白 N端具有一个高度保守的 NAC结构域 ; 进化树分
析表明 CsNAC属于 NAC蛋白家族的 ATAF亚家族 , 可能参与胁迫反应。荧光定量 PCR表达分析结果表明 ,
CsNAC在果实贮藏过程中 , 随着果皮褐变的发生 , 与对照相比褐变果皮中的表达水平明显增强。说明
CsNAC基因与脐橙果实的果皮褐变具有密切关系。
关键词 : 柑橘 ; 克隆 ; 表达 ; CsNAC
中图分类号 : S 66614　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2008) 1221803206
C lon ing of C sNAC Gene from Navel O range and Its Expression Ana lysis
D ur ing the Storage of Fru its
FAN J ing, L I Zheng2guo3 , GAO Xue, YANG Ying2wu, and DENG W ei
(Genetic Eng ineering Research Cen ter, B io2Engineering College, Chongqing U niversity, Key Laboratory of Functional Gene and
N ew Regulation Technolog ies under Chongqing M unicipa l Education Comm ission, Chongqing 400044, China)
Abstract: Based on the cDNA subtraction library which had been constructed to identify differentially ex2
p ressed genes in peel p itting of citrus fruit, the full2length cDNA sequence of CsNAC homologous to NAC gene
fam ily was isolated from navel orange (C itrus sinensis O sbeck) by RACE ( rap id amp lification of cDNA ends).
CsNAC is of 1 203 nucleotides encoding a p rotein of 305 am ino acids. The calculated molecular weight of the
CsNAC p rotein was 3512 kD and theoretical isoelectric point was 6172. Sequence analysis showed that the Cs2
NAC p rotein had a strikingly conserved region at the N2term inus, which is considered as the characteristic of
NAC p rotein fam ily. Phylogenetic analysis confirmed CsNAC belonged to the ATAF subfam ily, which p lays an
important role in response to stress stimuli. The exp ression of CsNAC was enhanced in the p itting peel com2
pared to healthy peel during the storage by real2time quantitative PCR, indicating that CsNAC is involved in
the development of the peel p itting of navel orange fruits.
Key words: C itrus sinensis O sbeck; cloning; exp ression; CsNAC
植物 NAC结构域蛋白是一种特异性转录因子 , 在植物的生长发育过程中起着重要作用 ( Kusano
et al. , 1995; Nagano et al. , 2001; Singh et al. , 2002)。该家族蛋白的共同特征是具有高度保守的 N端
和高度可变的 C端。其中 , N端的亚结构域 C可能参与 DNA结合过程 ( Kikuchi et al. , 2000) , 而亚
结构域 E可能参与许多生长发育阶段或者与组织多样性有关 , 还可能与亚结构域 D协同作用与 DNA
结合 (Duval et al. , 2002)。到目前为止 , 人们发现 NAC基因参与植物许多生长发育阶段 , 比如 : 侧
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根的形成 (Xie et al. , 2000) , 叶片与组织的衰老 ( John et al. , 1997) , 花原基的形成 ( Sablowski &
Meyerowitz, 1998) , 以及对生物与非生物环境的胁迫反应等 (Hegedus et al. , 2003)。但目前尚未见
该基因与果皮衰老的相关报导。
‘奉园 7221’脐橙 (C itrus sinensis O sbeck) 是一个优良的甜橙鲜食品种 , 但果皮容易发生褐变 ,
主要症状为油胞破裂下陷 , 形成褐斑 , 影响果实的感官品质和商品价值。目前 , 对脐橙果皮褐变的诱
发因素已有大量研究 , 但在分子机理方面尚十分缺乏。在作者前期研究中 , 运用抑制差减杂交方法 ,
分别以褐变和未褐变的柑橘果皮作为检测方和驱动方 , 构建了脐橙果皮褐变相关基因的 cDNA差减文
库 ( Gao et al. , 2006)。该文库中 EST所蕴含的信息主要涉及植物衰老与抗胁迫反应。作者从文库中
筛选一个与 NAC基因同源的 EST序列 , 通过 RACE法扩增得到其全长 cDNA序列 , 对其推测的氨基
酸序列进行同源性和进化树分析 , 并运用荧光定量 PCR方法分析了该基因在果实贮藏过程中正常果
皮与褐变果皮中的表达 , 为明确 NAC结构域蛋白基因与柑橘果皮褐变的关系 , 以及阐明柑橘果皮褐
变的发病机理提供参考依据。
1　材料与方法
111　材料
植物材料 ‘奉园 7221’脐橙 (C itrus sinensis O sbeck) 果实材料采自重庆市奉节县柑橘果园 , 为
花后 240 d采样。果实采后塑料薄膜袋单果包装 , 室温 (约 15 ℃ ) 贮藏 , 定期取正常果皮、发病果
皮 , 用液氮速冻 , 保存于 - 80 ℃备用。
大肠杆菌 E1coli JM109菌株为重庆大学生物工程学院基因工程研究中心保存。
112　RACE法扩增 C sNAC基因全长 cD NA序列
从 Gao等 (2006) 建立的柑橘果皮褐变相关基因的抑制差减文库中筛选到一个与 NAC结构域蛋
白基因同源的 EST序列 , 长 308 bp。利用 GenBank在线数据库对该序列进行同源性分析表明 , 它具
备完整的 5′端而缺失 3′端序列。因此利用 3′2Full RACE Core Set ( TaKaRa) 试剂盒克隆该基因的 3′端
未知序列。
根据已知的 EST序列 , 利用引物设计软件 Primer Prem ier 510设计基因特异性上游引物 P1 (5′2
AACATAGAAAGACCAAGCG23′) , 引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。利用上游引
物 P1和 3′RACE试剂盒提供的 3′端接头引物扩增目的基因的未知 3′端序列。PCR反应体系 : 10 ×
PCR缓冲液 215μL, MgCl2 (25 mmol·L - 1 ) 115μL, dNTP (10 mmol·L - 1 ) 015μL, Taq DNA聚合
酶 (5 U·μL - 1 ) 0125μL, 引物 P1 (20μmol·L - 1 ) 015μL, 3′端接头引物 (20μmol·L - 1 ) 015μL,
补水至 25μL。PCR反应条件 : 预变性 94 ℃ 5 m in; 94 ℃ 40 s, 52 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 m in, 32个循环 ;
充分延伸 72 ℃ 10 m in。PCR产物用浓度为 1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离 , 利用 UN IQ210柱式 DNA
胶回收试剂盒回收纯化目标产物 , 连接至 pGEM 2T Easy载体 ( Promega, USA ) , 转化大肠杆菌 JM109
感受态 , 通过蓝白斑筛选以及 PCR鉴定后 , 挑取阳性克隆送往上海生工生物工程技术服务有限公司
测序。
113　C sNAC基因的序列分析
利用 DNAMAN 51212软件将测序结果与已知序列进行拼接 , 得到 CsNAC基因全长 cDNA序列。
将全长序列在 NCB I进行 BLAST ( http: / /www1ncbi1nlm1nih1gov /BLAST) 同源性分析 , 并利用在线
软件 ( http: / /www1expasy1org) 预测其开放阅读框与编码的蛋白质的分子量、等电点和保守结构域
等。
采用 MEGA 410软件 , 把 CsNAC与其他植物中的 NAC结构域蛋白的氨基酸序列进行多重比对 ,
运用 Neighbor2Joining方法 , 构建无根进化树。
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　12期 樊 　晶等 : 脐橙 CsNAC基因的克隆及其在果实贮藏过程中的表达分析 　
114　C sNAC基因的组织特异性表达分析
11411　引物设计 　利用 Primer Exp ress软件 (AB I, USA ) 分别设计了管家基因 ubiqu itin和 CsNAC基
因的特异性引物 , 见表 1。
表 1　荧光定量 PCR分析使用引物
Table 1　Pr im er sequences for quan tita tive RT2PCR ana lysis
引物 Primer 引物序列 (5′- 3′) Sequence (5′- 3′) 备注 Remark
UB I2F TCTTCGCAGGAAAGCAAC 管家基因前引物 ubiquitin forward p rimer
UB I2R CCTCAGACGCAAAACCAG 管家基因后引物 ubiquitin reverse p rimer
CsNAC2F AACATAGAAAGACCAAGCG CsNAC基因前引物 CsNAC forward p rimer
CsNAC2R CGGCAATAATAGGAACAGA CsNAC基因后引物 CsNAC reverse p rimer
11412　总 RNA提取及 cDNA合成 　按照植物 RNA小量抽提试剂盒 (W atson B iotech) 操作说明书 ,
提取各组织材料的总 RNA。用 DNase I ( TaKaRa) 处理总 RNA , 排除 DNA污染。用 M 2MLV反转录酶
( Promega) 合成第一链 cDNA。
11413　荧光定量 PCR表达分析 　本试验采用 SYBR Green I荧光染料法 , 仪器是 iCyclerTM Real Time
PCR System (B io2Rad, USA) , 反应混合液为 SYBRµ Prem ix Ex TaqTMMaster m ix kit ( TaKaRa, Japan)。
反应体系为 (25μL) : 2 ×SYBRµ P rem ix Ex TaqTMMaster m ix, ubiqu itin和 CsNAC引物 (终浓度分别为
011μmol·L - 1、012μmol·L - 1 ) , 适量模板。反应程序为 : 95 ℃ 30 s, 1个循环 ; 95 ℃ 10 s, 55 ℃
30 s, 72 ℃ 20 s, 42个循环。为了确保结果的可重复性 , 每个反应设置 3次重复。PCR扩增结束后立
即进行熔解曲线分析 , 以验证扩增的特异性。熔解曲线的程序为 : 95 ℃ 1 m in; 55 ℃ 1 m in; 从 55
℃开始每升高 015 ℃保持 10 s, 连续升高 80次 (到 95 ℃为止 )。
数据处理 : 实时荧光定量 PCR反应完成后 , iCyclerTM software version 310自动计算出各个板位的
CT , 将 CT值输入到 M icrosoft Excel 2003中 , 按照公式 △△CT = (CT, Target - CT, Reference ) Treated - (CT, Target
- CT, Reference ) Untreated计算 CsNAC基因相对表达量 (L ivak & Schm ittgen, 2001) , 并绘制基因表达差异的
柱形图。其中 , CT, Targe t表示目的基因的 CT值 , CT, Reference表示参照基因的 CT值 , Treated和 Untreated分
别表示处理组与对照组。
2　结果与分析
211　RACE扩增 CsNAC全长 cD NA及其序列分析
根据文库中与 NAC基因同源的 308 bp EST序列 , 利用 3′2Full RACE Core Set ( TaKaRa) 试剂盒
得到其 3′端未知序列 , 并通过两序列拼接及设计全长引物验证 , 成功得到 CsNAC基因全长 cDNA序
列 1 203 bp。
利用在线软件 ( http: / /www1expasy1org) 预测 CsNAC包含一个 915 bp的开放阅读框 (ORF) ,
编码一个 305个氨基酸的多肽 , 其分子量为 3512 kD, 等电点为 6172。亚细胞定位分析表明 , CsNAC
既没有信号肽 , 也没有核定位信号序列。保守结构域分析表明 , 在 CsNAC蛋白质的 N端有一个保守
的结构域名为 NAM , 此结构域存在于植物特异性转录因子 NAC蛋白的氨基端。
CsNAC基因全长核苷酸序列和编码的氨基酸序列如图 1所示。推测的 CsNAC蛋白具有一个保守
的 NAC结构域 , 可能行使着与 DNA结合的功能。CsNAC还有以下结构特征 : N端糖基化位点、蛋白
激酶 C磷酸化位点、酪蛋白激酶 Ⅱ磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点和 N端豆蔻酰化位点。其羧
基端还包含一个非结构化区域。
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图 1　CsNAC基因核苷酸序列和推测的氨基酸序列
下划线表示起始密码子 ATG和终止密码子 TAA, 阴影部分表示 NAC结构域 , 黑体加下划线表示非结构化区域。
F ig. 1　Nucleotide sequence and deduced am ino ac id sequence of CsNAC
ATG ( initial codon) and TAA ( stop codon) are underlined. The NAC domain of CsNAC is shaded.
Bold and underlined sequences indicate the unstructured region.
利用 MEGA 410软件 , 对 CsNAC与其他 NAC结构域蛋白进行进化树分析 , 结果如图 2所示。图
中标出了 NAC蛋白的几个主要亚家族 , 分别为 ATAF、A tNAC3和 NAM亚家族。CsNAC属于 ATAF
亚家族 , 其成员包括 ATAF1、ATAF2、O sNAC5、O sNAC6和 StNAC等。这一结果表明 , CsNAC与
NAC结构域蛋白家族中的 ATAF亚家族成员具有功能相似性 , 即参与胁迫反应。
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　12期 樊 　晶等 : 脐橙 CsNAC基因的克隆及其在果实贮藏过程中的表达分析 　
图 2　C sNAC的进化树分析
F ig. 2　Phylogenetic tree of C sNAC prote in
212　C sNAC基因在不同贮藏期果皮中的表达分析
由于采用的是 SYBR Green I荧光染料法 , PCR产物中所有双链 DNA都会结合 SYBR Green I, 从
而产生荧光。因此为了保证 PCR扩增产物的特异性 , 必须进行熔解曲线分析。目的基因 CsNAC及管
家基因 ubiqu itin定量 PCR扩增产物的熔解曲线分析结果表明其熔解曲线都呈单峰 (数据未列出 ) , 说
明它们的扩增产物都是特异的 , 没有非特异扩增产物或引物二聚体。
CsNAC基因在不同贮藏期果皮组织中的表达模式如图 3所示。以刚采收的正常果皮为对照 , 以其
CsNAC基因的相对表达量为 1。结果表明 , CsNAC基因表达随着贮藏期延长 , 在正常果皮中的表达量
略有增强 , 但在同期褐变果皮明显增强。随着果皮褐变的加重 (李正国 等 , 2006) , 其表达水平也
相应升高。果实贮藏 55 d后 , 其表达水平增强了近 5倍。
图 3　CsNAC基因在不同贮藏时期脐橙果皮组织中的表达
以刚采收正常果皮作为对照 , 将其相对表达量定义为 1。
F ig. 3　The expression of CsNAC m on itored by quan tita tive RT2PCR in d ifferen t peel tissues dur ing the storage
The calibrator whose relative exp ression was arbitrarily set as equal to one defined as the samp le giving the
highest △CT value which corresponded to the lowest level of exp ression. The quantification of
the relative exp ression levels was performed by the comparative CT method.
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3　讨论
利用 RACE方法获得 CsNAC 全长 cDNA 序列 1 203 bp, 编码 305个氨基酸。序列分析表明 ,
CsNAC蛋白的 N端具有一个高度保守的 NAC结构域 , 可能行使着 DNA结合域的功能。进化树分析表
明 , CsNAC蛋白属于 NAC结构域蛋白的 ATAF亚家族。许多研究报道 , ATAF亚家族蛋白成员 AT2
AF1, ATAF2和 StNAC在损伤胁迫下 , 其表达水平迅速而短暂增强。同样属于 ATAF亚家族的 O s2
NAC6, 参与各种胁迫反应 (Collinge & Boller, 2001)。甘蔗的 SsNAC23参与低温胁迫反应 , 在水胁迫
条件下其表达被诱导。这些研究结果说明 , ATAF亚家族的 NAC结构域蛋白普遍参与了胁迫反应。
因此 , CsNAC也参与胁迫反应。
表达分析结果表明 , CsNAC基因随着脐橙贮藏期的延长 , 果皮衰老和褐变的加重 , 其表达水平相
应上升 , 并在褐变果皮中表达水平显著升高。已有研究表明 , NAC基因家族参与植物发育的多个阶
段 , CsNAC基因在褐变果皮中的表达水平明显高于正常果皮 , 说明该基因与果皮褐变密切相关。该基
因作为一个与植物组织衰老相关的转录因子 , 在果皮褐变这一衰老过程中 , 可能通过调节其它相关基
因的表达 , 从而促进了柑橘果皮褐变的发生。但具体调节过程尚有待更深入的研究。
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