全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 847 - 852
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 04 - 03; 修回日期 : 2007 - 05 - 30
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2002AA241191)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fchqcrip@1261com)
梨新品种及其亲本的 AFL P分析
王　斐 , 林盛华 , 方成泉 3 , 李连文
(中国农业科学院果树研究所 , 辽宁兴城 125100)
摘 　要 : 利用荧光 AFLP技术 , 对 20个梨新品种及其 23个亲本 (共 43个品种 ) 进行研究。从 64对
引物组合中筛选出 7对用于扩增 , 共获得 784条带 , 其中多态性带 699条 , 多态性为 8912%。扩增结果显
示 , 7对引物组合在 29个品种中扩增出特征带 , 每对引物组合均能将所有品种鉴别开 , 表明荧光 AFLP技
术用于梨品种鉴定的效率很高。通过聚类 , 从分子水平对梨新品种及其亲本的遗传关系进行分析 , 并对 20
个梨新品种进行分类 , 为梨杂交育种的亲本选配提供了理论参考。
关键词 : 梨 ; 品种 ; 鉴定 ; 荧光 AFLP; 指纹图谱
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0420847206
AFL P Ana lysis of New Pear Cultivars and The ir Paren ts
WANG Fei, L IN Sheng2hua, FANG Cheng2quan3 , and L IL ian2wen
(Research Institu te of Pom ology, Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, X ingcheng, L iaoning 125100, Ch ina)
Abstract: Forty2three pear cultivars including 20 new pear cultivars and their parents were subjected to
fluorescent AFLP ( amp lified fragments length polymorphism ) analysis. Seven p rimer combinations selected
from 64 p rimer combinations p roduced a total of 784 fragments, of which 699 were polymorphic with a poly2
morphism percentage of 8912%. The results showed that characteristic bands were amp lified from 29 culti2
vars, and any p rimer combination could identify all the cultivars. Fluorescent AFLP was p roved to be a very
reliable method to identify pear cultivars. The genetic relationship between new pear cultivars and their parents
was analyzed and 20 new cultivars were classified on molecular level by clustered analysis, which p rovided
theoretical reference for parent selection in pear hybridization breeding.
Key words: Pyrus; Cultivar; Identification; Fluorescent AFLP; Fingerp rinting
我国梨种质资源丰富 , 栽培历史悠久 , 通过各种选育方法 , 梨的品种不断增多。梨大多采用无性
繁殖 , 随着梨种质的交流 , 品种混杂的现象较为多见 , 利用形态学等传统的鉴别方法很难对品种进行
准确的鉴定和分类。应用 RAPD (O liveira et al. , 1999; Monte2Corvo et al. , 2000; Teng et al. ,
2002)、AFLP (L in et al. , 2002; Pan et al. , 2002)、SSR ( Kimura et al. , 2002) 及将 RAPD标记转
化为 SCAR标记 ( Kim et al. , 2000; Lee et al. , 2004) 等方法 , 可以较准确地对梨属植物进行分类、
亲缘关系分析和品种鉴定。
作者通过荧光 AFLP技术从分子水平对亲缘关系较近的梨新品种及其亲本进行品种鉴定和遗传
关系分析 , 旨在探索该技术在梨品种鉴定上的高效性 , 以期为梨新品种的鉴定、保护和利用提供
借鉴。通过遗传关系和分类研究 , 为梨杂交育种亲本的选配提供理论依据 , 以更好地指导梨杂交
育种研究。
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
1　材料与方法
111　材料
试材取自中国农业科学院果树研究所国家果树种质兴城梨资源圃和梨育种高接圃 , 共 43个梨品
种 [ 20个新品种 (1～20) 及其亲本 (21～43) ] , 其分属秋子梨、白梨、砂梨和西洋梨 4个种 (表 1)。
表 1　供试梨品种
Table 1　Pear cultivars used in th is study
编号
Code
品种
Cultivars
所属种
Species
编号
Code
品种
Cultivars
所属种
Species
1 早酥 (苹果梨 ×身不知 ) Zaosu ( Pingguoli ×M ishirazu) b 23 新世纪 Shinseiki p
2 锦丰 (苹果梨 ×慈梨 ) J infeng ( Pingguoli ×Cili) b 24 幸水 Kosui p
3 五九香 (鸭梨 ×巴梨 )W ujiuxiang ( Yali ×Bartlett) c 25 茄梨 Clapppis Favorite c
4 华酥 (早酥 ×八云 ) Huasu ( Zaosu ×Yakumo) b 26 乔马 Tёma c
5 华金 (早酥 ×早白 ) Huajin ( Zaosu ×Zaobai) b 27 鸭梨 Yali b
6 锦香 (南果 ×巴梨 ) J inxiang (Nanguo ×Bartlett) c 28 巴梨 Bartlett c
7 红香酥 (库尔勒香梨 ×郑州鹅梨 ) Hongxiangsu ( Kuerle Xiangli ×Zhengzhou Eli) b 29 雪花 Xuehua b
8 早美酥 (新世纪 ×早酥 ) Zaomeisu ( Shinseiki ×Zaosu) p 30 小香水 Xiaoxiangshui u
9 七月酥 (幸水 ×早酥 ) Q iyuesu ( Kosui ×Zaosu) p 31 慈梨 Cili b
10 中梨一号 (新世纪 ×早酥 ) Zhongli 1 ( Shinseiki ×Zaosu) p 32 金水一号 J inshui 1 p
11 八月红 (茄梨 ×早酥 ) Bayuehong (Clapppis Favorite ×Zaosu) c 33 秋白 Q iubai b
12 北丰 (乔马 ×早酥 ) Beifeng ( TÄma ×Zaosu) c 34 身不知 M ishirazu c
13 冀蜜 (雪花 ×黄花 ) J im i (Xuehua ×Huanghua) b 35 郑州鹅梨 Zhengzhou Eli b
14 黄冠 (雪花 ×新世纪 ) Huangguan (Xuehua ×Shinseiki) b 36 八云 Yakumo p
15 早香一号 (小香水 ×二十世纪 ) Zaoxiang 1 (Xiaoxiangshui ×N ijisseiki) u 37 南果 Nanguo u
16 金水秋 (慈梨 ×晚三吉 ) J inshuiqiu (Cili ×Okusankichi) b 38 黄花 Huanghua p
17 晚香 (乔马 ×大冬果 )W anxiang ( TÄma ×Dadongguo) b 39 二十世纪 N ijisseiki p
18 金水酥 (兴隆麻梨 ×金水一号 ) J inshuisu (XinglongMali ×J inshui 1) b 40 晚三吉 Okusankichi p
19 早魁 (雪花 ×黄花 ) Zaokui (Xuehua ×Huanghua) b 41 大冬果 Dadongguo b
20 桔蜜 (京白 ×秋白 ) Jum i (J ingbai ×Q iubai) b 42 兴隆麻梨 Xinglong Mali b
21 苹果梨 Pingguoli b 43 京白 J ingbai u
22 库尔勒香梨 Kuerle Xiangli b
　　注 : b: 白梨 ; c: 西洋梨 ; p: 砂梨 ; u: 秋子梨。
Note: b: Pyrus bretschneideri Rehd. ; c: Pyrus comm unis L. ; p: Pyrus pyrifolia Nakai; u: Pyrus ussuriensis Maxim.
112　方法
4月下旬取新梢嫩叶 , 用蒸馏水冲洗干净 , 吸干水后按 014 g分装到冷藏管中 , 放入 - 70℃冰箱
备用。基因组 DNA提取参考鲁凤娟 (2004) 的方法。基因组 DNA质量通过 Gene spec V核酸蛋白分
析仪和 018%琼脂糖凝胶电泳检测。将符合要求的 DNA样品稀释成浓度为 100 ng·μL - 1 , 待用。
荧光 AFLP分析体系的反应条件、试剂用量均按照 IRDyeTM Fluorescent AFLP Kit说明进行。酶切
反应体系为 1215μL, 包括 5 ×Reaction buffer 215μL, 模板 DNA 110μL (100 ng·μL - 1 ) , EcoRⅠ /
M seⅠ enzyme m ix 110μL和去离子水 810μL。混合离心后 , 37℃保温 2 h, 70℃保温 15 m in。在酶切
产物中加入 1210μL Adap ter m ix和 015μL T4 DNA ligase为接头连接的反应体系 (共 2510μL ) ,
20℃连接 2 h, 将连接产物稀释 10倍后进行预扩增反应。预扩增反应体系为 2515μL, 含稀释的酶切
连接产物 215μL, AFLP Pre2amp p rimer m ix 2010μL, 10 ×PCR reaction buffer 215μL和 Taq DNA
polymerase (5 units·μL - 1 ) 015μL。反应程序为 : 94℃变性 30 s, 56℃退火 1 m in, 72℃延伸 1 m in,
20个循环 , 将产物稀释 40倍用于选择性扩增。选择性扩增反应体系为 1110μL, 包括 Taq DNA poly2
merase working m ix 610μL, 稀释的预扩增产物 210μL, M seⅠp rimer 210μL, EcoRⅠp rimer A 015μL,
EcoRⅠp rimer B 015μL。反应程序为 : 94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 1 m in, 1个循环 ; 94℃ 30 s,
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　4期 王 　斐等 : 梨新品种及其亲本的 AFLP分析 　
65℃ (每循环降低 017℃) 30 s, 72℃ 1 m in, 12个循环 ; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 m in, 23个
循环。其中 EcoRⅠ引物用荧光染料进行标记。
将选择性扩增产物 018μL载于 615%聚丙烯酰胺凝胶 , 在 L I2COR 4300 DNA 测序仪上进行电
泳。电泳结束后 , 通过 SAGAMX软件对数据进行处理 , 采用 SPSS ( 1310版 ) 软件对统计结果进行
分析 , 用 W ardpis method (离差平方和法 ) 计算品种间的遗传距离 (用欧氏距离表示 ) , 并进行聚
类分析。
2　结果与分析
211　AFL P多态性分析
从 64对引物组合中筛选出 7对带型清晰且多
态性较高的引物组合用于 AFLP分析。
7对引物组合在 43个梨品种中总共扩增出
784条带 , 其中多态性条带 699条 , 多态性百分
率为 8912 % , 平均每对引物组合产生 112条带
(表 2)。
图 1为引物组合 M 2CTC /E2AAC的扩增结果。 表 2　7对引物组合的扩增结果及产生的多态性Table 2　Am plif ied results and polym orph ismof 7 pr im er com b ina tion s引物组合Primer combination 总条带数Totalbands 多态性条带Polymorphicbands 多态性百分率Polymorphicpercentage (% )M2CTG/E2AAC (M7 /E2) 86 73 8419M2CTC /E2AAC (M6 /E2) 145 132 9110M2CTG/E2AAG(M7 /E1) 105 87 8217M2CAA /E2ACC (M1 /E3) 132 126 9515M2CAC /E2ACT(M2 /E7) 83 79 9512M2CAC /E2AAG(M2 /E1) 140 122 8711M2CAC /E2AAC (M2 /E2) 93 80 8610总计 Total 784 699 8912
图 1　引物组合 M 2CTC /E2AAC扩增结果
1～43的品种名详见表 1。
F ig. 1　Result am plif ied by pr im er com b ina tion M 2CTC /E2AAC
Names of 1 - 43 are elaborated in Table 1.
212　品种特征带及品种鉴定
本试验筛选出的每对引物组合均能在不同的品种上产生不同的带型。在供试的 43个品种中有 29
个品种扩增出特征带。筛选出的 7对引物组合都能将所有品种鉴别开。由此可见荧光 AFLP技术可以
高效准确地对梨属植物进行品种鉴定。具有特征带的品种及其特征带的大小、表现形式见表 3。
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
表 3　具有特征带的品种及特征带大小
Table 3　Cultivars w ith character istic bands and ba se pa irs of the bands
品种
Cultivar
特征带数量
Number of
characteristic bands
表现为“存在”的特征带
Characteristic bands
rep resent p resent ( bp)
表现为“缺失”的特征带
Characteristic bands
rep resent absent ( bp)
早魁 Zaokui 2 M7 /E22105 M6 /E22443
晚三吉 Okusankichi 6 M2 /E12351 M7 /E22158 M1 /E32133 M2 /E22254
M7 /E12219 M7 /E12243
八云 Yakumo 1 M6 /E22123
库尔勒香梨 Kuerle Xiangli 1 M6 /E22136
京白 J ingbai 10 M6 /E22455 M6 /E22157 M6 /E22208 M6 /E22495
M6 /E22506 M7 /E12459 M1 /E321381
M1 /E32381 M2 /E12108 M2 /E12621
黄花 Huanghua 1 M6 /E22236
兴隆麻梨 XinglongMali 3 M6 /E22341 M1 /E32111 M1 /E32325
郑州鹅梨 Zhengzhou Eli 4 M6 /E22377 M2 /E72133 M2 /E2263
M2 /E22240
乔马 TÄma 3 M6 /E22409 M7 /E12550 M2 /E12277
金水一号 J inshui 1 1 M6 /E22467
茄梨 Clapppis Favorite 2 M6 /E22525 M2 /E12391
桔蜜 Jum i 1 M6 /E22535
早香一号 Zaoxiang 1 2 M6 /E22575 M2 /E12175
晚香 W anxiang 3 M6 /E22694 M2 /E12563 M2 /E22204
秋白 Q iubai 2 M7 /E12158 M2 /E12293
华金 Huajin 2 M1 /E32678 M7 /E12252
五九香 W ujiuxiang 1 M7 /E12303
大冬果 Dadongguo 5 M7 /E12304 M7 /E12507 M1 /E32223
M2 /E22346 M2 /E22394
金水秋 J inshuiqiu 1 M1 /E32157
华酥 Huasu 3 M1 /E32451 M2 /E72542 M2 /E12669
锦香 J inxiang 3 M1 /E32475 M1 /E32655 M2 /E22459
身不知 M ishirazu 1 M1 /E32591
红香酥 Hongxiangsu 2 M2 /E22453 M2 /E7281
金水酥 J inshuisu 2 M2 /E7287 M2 /E2286
巴梨 Bartlett 1 M2 /E7288
中梨一号 Zhongli 1 1 M2 /E72217
新世纪 Shinseiki 2 M2 /E12246 M2 /E12315
北丰 Beifeng 1 M2 /E22218
苹果梨 Pingguoli 1 M2 /E22396
213　新品种与亲本的遗传关系分析
对 AFLP统计结果进行聚类分析 , 得到亲缘关系树状图 (图 2)。当阈值在 14左右时 , 所有品种
聚为 4个组 : Ⅰ砂梨组 , 包括砂梨以及含有砂梨血缘的品种 ; Ⅱ秋子梨组 , 包括秋子梨和含有秋子梨
血缘的品种 ; Ⅲ白梨组 , 包括白梨和含有白梨血缘的品种 ; Ⅳ西洋梨组 , 包括西洋梨和含有西洋梨血
缘的品种。
20个梨新品种在聚类过程中 , 有的与母本聚在同一组中 , 有的与父本聚在同一组中 , 有的不与
任何一个亲本聚在一起。据此 , 将 20个新品种分为 3个类型 : 趋母本聚类型 , 即聚在母本所在的组
中 , 与母本的亲缘关系较近 , 共 9个品种 , 占所有新品种的 4510% ; 趋父本聚类型 , 即聚在父本所
在的组中 , 与父本的亲缘关系较近 , 共 9个品种 , 占所有新品种的 4510% ; 不与亲本聚类型 , 即不
聚在任何一个亲本所在的组中 , 只有两个品种 , 占所有新品种的 1010%。‘早酥 ’、‘锦丰 ’和 ‘红
香酥 ’均与父、母本聚在同一组中 , 但三者与母本的遗传距离较近 , 因此 , 将 ‘早酥 ’、‘锦丰 ’和
‘红香酥 ’归为趋母本聚类型。新品种聚类所在组及聚类类型详见表 4。
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　4期 王 　斐等 : 梨新品种及其亲本的 AFLP分析 　
图 2　聚类树状图
1～43的品种名详见表 1。
F ig. 2　D endrogram
Names of 1 - 43 are elaborated in Table 1.
表 4　新品种聚类所在组及聚类类型
Table 4　C lustered group and clustered type of new cultivars
聚类所在组
Clustered group
趋母本聚类型
Mother2tended cluster type 趋父本聚类型Father2tended cluster type 不与亲本聚类型Deviated type
砂梨组 Pyrus pyrifolia Nakai 早美酥 , 中梨一号
Zaomeisu, Zhongli 1
冀蜜 , 黄冠 , 金水秋 , 金水酥 , 早魁
J im i, Huangguan, J inshuiqiu,
J inshuisu, Zaokui
桔蜜 Jum i
秋子梨组 P. ussuriensis Maxim. 北丰 Beifeng
白梨组 P. bretschneideri Rehd. 早酥 , 锦丰 , 红香酥 , 华酥 , 华金
Zaosu, J infeng, Hongxiangsu,
Huasu, Huajin
七月酥 , 晚香 Q iyuesu, W anxiang 早香一号 Zaoxiang 1
西洋梨组 P. comm unis L. 八月红 Bayuehong 五九香 , 锦香 W ujiuxiang, J inxiang
3　讨论
311　新品种与亲本间遗传关系分析
虽然在 20个新品种中 , 4510%为趋母本聚类型 , 4510%为趋父本聚类型 , 不与亲本聚类型只占
1010% , 这说明在分子水平上 , 杂交后代表现出与父、母本的亲缘关系相一致 ; 然而在趋母本聚类型
的品种中 , ‘锦丰 ’、‘华酥 ’、‘红香酥 ’和 ‘北丰 ’4品种分别与各自的母本直接且紧密地聚在一
起 , 但在趋父本聚类型的品种中却没有出现这种现象。由此可见 , 杂交后代与母本的相似性大于父
本。因此 , 在进行杂交亲本的选配时 , 建议将具有重要性状以及一些少见的有利性状和可贵类型的品
种选作母本 , 这样在子代中出现目标性状的比例会大一些。虽荧光 AFLP技术在梨属植物遗传关系上
的研究尚未见报道 , 但本研究可为杂交育种提供理论依据与参考。有关 ‘早香一号 ’和 ‘桔蜜 ’两
个品种出现偏离现象的原因 , 有待进一步研究。
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312　‘身不知 ’和 ‘库尔勒香梨 ’的分类
‘身不知 ’是引自日本 (　浦一郎和佐藤義彦 , 1990) 的西洋梨品种 , 蒲富慎等 (1989) 推测其
可能是砂梨与西洋梨的杂交种。然而在本试验中 , 其既不与西洋梨聚类也不与砂梨聚类 , 而与白梨聚
在一起。从指纹图谱可以看出 , ‘身不知 ’与西洋梨的相同谱带较多 , 判断其亲本之一是西洋梨。
‘身不知 ’适应性强 , 在吉林延边地区和辽宁西部均有栽培 , 其抗寒性不及秋子梨 , 但与白梨相近 ,
比砂梨强 , 故推测其另一亲本不是砂梨 , 而是白梨 , 该结果有待进一步验证。
‘库尔勒香梨 ’是新疆地区的主栽品种 , 一般归于白梨。孢粉学研究认为 , ‘库尔勒香梨 ’的花
粉表面纹饰倾向于西洋梨 , 再加上果实香味较浓 , 推测其可能是白梨与西洋梨的种间杂种 (杨槐俊 ,
1985; 邹乐敏 等 , 1986) ; Teng等 ( 2001) 用 RAPD 方法对新疆梨进行亲缘关系分析 , 结果表明
‘库尔勒香梨 ’与西洋梨具有共同谱带 , 结合其脆肉特性和叶片形状 , 亦认为其是白梨与西洋梨的种
间杂种 ; 本研究结果显示 , ‘库尔勒香梨 ’聚在白梨组 , 与白梨具有较近的亲缘关系 , 但从指纹图谱
可以看出 , 其还具有较多与西洋梨相同的谱带 , 说明其含有西洋梨血缘 , 这也验证了上述观点。
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