全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(8)：1137—1146
Acta Horticuhurae Sinica
番茄 S一腺苷蛋氨酸脱羧酶基因 S1SAMDCI的克隆
与序列分析
刘志勇 一，王孝宣 ，高建昌 ，国艳梅 ，杜永臣 ，叶雪凌
( 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081； 上海市农业科学院园艺所，上海201 106； 首都师范大学生命科
学学院，北京 100037)
摘 要：以蔓陀罗 s一腺苷蛋氨酸脱羧酶全长 cDNA序列为信息探针，筛选 NCBI番茄 EST数据库，依
据同源 EST信息，经人工拼接、RT—PCR及 RACE技术验证，获得了 1个新的 SAMDC基因家族成员，命名
为 SISAMDC1(GenBank登 录号：EF550528)，并利用染色体步移技术克隆了 879 bp的上游调控区域。
SISAMDC1 cDNA序列全长 1 847 bp，5 ．UTR和 3，_UTR分别长 523和241 bp；存在 3个 ORF(微型 uORF、
小型 uORF和主 ORF)，主 ORF编码 360个氨基酸的SAMDC酶原；SISAMDC1基因组序列全长3 648 bp，有
3个内含子 ，均位于5 UTR，所有内含子的剪切位点均符合真核生物 “GT—AG”规则。SISAMDC1基因与其
它植物来源 SAMDC基因同源性较高，与人、大肠杆菌以及酵母的同源性较低。表达谱分析发现，SISAM-
DC1基因在番茄根、茎、叶、花蕾 、果实等器官中均表达，果实中的表达量相对较高。生物信息学分析表
明，SISMDC1基因的上游调控序列存在多个顺式作用元件，如 W—box、 rATA—box、CAAT—box等。
关键词：番茄；多胺；s一腺苷蛋氨酸脱羧酶；基因克隆
中图分类号：S 641，2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2008)08—1137—10
Cloning and Sequence Analysis of a S—adenosylmethionine Decarboxylase
Gene(SISAMDC1)in Tomato
LIU Zhi—yong ’ ，WANG Xiao—xuan ，GAO Jian—chang ，GUO Yan—mei ，DU Yong—chen ，and YE Xue—
ling
( Institute ofVegetables and Flowers，Chinese Academy ofAgricultural Sciences，Beijing 100081，China， Horticultural Research
Institute，Shanghai Academy ofAgricultural Sciences，Shanghai 201 106，China； College ofLife Science，Capital Normal Univer-
sity，Beijing 100037，China)
Abstract：The SAMDC cDNA sequence from iimsonwead(GenBank accession No．：Y07768)was used
as electronic probe to hybridize tomato ESTs in GenBank through Blastn search．Based on the contig assem—
bled from homologous ESTs．the fu11一length cDNA of a new member of ^ C family in tomato was cloned U．
sing RT—PCR and RACE，which iS 1 847 bp in length with a 523 bp 5 一UTR and a 241 bp 3 ．UTR．Corre—
sponding DNA sequence is 3 648 bp，containing three introns in 5 UTR，and all the cleave sites obey with
the GT—AG rule．The gene was designated as Sl5A DC1(GenBank accession No．EF550528 ．SZ DC1
consists of three ORFs(tiny uORF．small uORF and main ORF)．and the main ORF encodes 360 amino
acids with a calculated molecular weight of 39 kD．The comparison of deduced amino acid sequence revealed
that SlsAMDC1 S highly homologous to other plant sAMDCs．but、ess similar to human and yeast’S．RT—PCR
analysis showed that expression level of Sl鲥 DC1 was higher in fruit than in any other organs．The upstream
regulatory sequence was cloned by genome walking．Further analysis showed that the upstream regu latory se—
quence contains several C／s．acting elements(e．g．W．box．TATA．box．CAAT．box)．
收稿日期：2008—03—05；修回日期：2008—06—18
基金项目：国家自然科学基金项目 (30571274；30771474)；农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室项目
通讯作者Author for corespondence(E·mail：yongchen．du@mail．cBa$．net．cn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
l138 园 艺 学 报 35卷
Key words： tomato； Solanum lycopersicum； polyamine； S-adenosylmethionine decarboxylase； gene
cloning
多胺是生物体代谢过程中产生的具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱，主要包括二胺 (腐胺
和尸胺)，三胺 (亚精胺)，四胺 (精胺)等。多胺广泛参与生物体内的生理生化过程，在植物的胚
胎发育、性型分化、形态建成以及对外界生物逆境和非生物逆境反应中均起重要作用 (Kurepa et a1．，
1998；Bouchereau et a1．，1999；Shen et a1．，2000，Fos et a1．，2003)。
前人的研究表明，精胺、亚精胺与番茄的生长发育和抗逆反应密切相关 (Mehta et a1．，2002；
Song et a1．，2002；杜永臣 等，2003)。
s一腺苷蛋氨酸脱羧酶 (s．adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC，EC 4．1．1．50)是亚精胺和
精胺合成的限速酶 (Galston&Sawhney，1990)，催化s一腺苷蛋氨酸 (SAM)形成脱羧的 SAM，后
者为精胺和亚精胺的合成提供氨丙基。SAMDC属于古老的脱羧酶基因家族。已有多种植物的SAMDC
基因被克隆，如马铃薯 (Taylor et a1．，1992)、拟南芥 (Francescheti et a1．，2001)、水稻 (Li&
Chen，2000)、大豆 (Tian et a1．，2004)、苹果 (Hao et a1．，2005)等。植物中，一般有多个基因家
族成员编码SAMDC(Hu et a1．，2005)。目前，GenBank已收录了两个编码番茄SAMDC基因的mRNA
序列 (GenBank登录号：BTO13281和BTO13882)。
作者利用SAMDC基因在不同物种中进化的保守性，采取 “同源筛选”策略，克隆了一个番茄
SAMDC基 因家族 新成 员 的 cDNA 和 DNA 全长 序列，命 名 为 SISAMDC1(GenBank登 录号：
EF550528)，并利用改良染色体步移技术克隆了其上游调控序列。SISAMDC1基因的克隆为深入了解
番茄体内的多胺代谢奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 材料
所用番茄试材为 ‘Saladete’(美国番茄遗传中心，编号 LA2662)，种植在中国农业科学院蔬菜
花卉研究所日光温室。2006年春季，种子催芽后播种于育苗盘，幼苗长至 4叶期，移入花盆中，以
蛭石为培养介质，每两天浇一次 1／4 Hongland营养液。第一穗果长至直径 2 cm时，分别取根、茎、
叶、花蕾、果实，液氮速冻后 一80℃保存备用。
1．2 总RNA和DNA的提取及 cDNA第一链的合成
总 RNA提取按 Invitrogen公司 TRIzol试剂盒进行，用无 RNase的 DNaseI(天根公司)除去 RNA
中的痕量 DNA，调浓度至 1 g· L～。5 -RACE cDNA第一链的合成：根据 Invitrogen公司 Gene-
Racer’。M试剂盒操作手册，对各器官 RNA分别进行脱磷、脱帽处理，然后在 5 端加上 GeneRacer
RNA Oligo，利用 SuperScript反转录酶 Ⅲ，以基因特异性引物进行反转录。3 ．RACE和 RT．PCR的
cDNA第一链合成参照 TaKaRa公司 3 一RACE试剂盒说明书进行。参照 Wiliamson等 (1994)的方法
提取叶片 DNA。
1．3 番茄SAMDC基因全长 cDNA的克隆
以蔓陀罗 SAMDC全长 cDNA序列 (Y07768)为信息探针，在 NCBI番茄 EST数据库中进行
Blastn分析，找出与Y07768一致性较高且不属于 BTO13281和 BTO13882的 EST序列 (EG364952)。
以该 EST序列为种子序列，利用 DNASTAR软件包中的 MegAlign和 SeqMan功能，在 NCBI番茄 EST
数据库中进行电子延伸，直至重叠群不能继续延伸 (黄骥 等，2002)。设计 1对 PCR 引物 GSP1
(5 -ACCATCCTGATATTCCCTAA．3 )和 GsP2(5 一GAACACCAAAAGGCAAGAC-3 )，以混合 cDNA为
模板，进行 PCR扩增，验证延伸结果。PCR反应条件：94℃变性5 min；94 oC 30 S，50 oC 30 S，72
维普资讯 http://www.cqvip.com
8期 刘志勇等 ： 番茄 S 一 腺苷蛋氨酸脱羧酶基 因 S IS A M D C l的克隆与序列分析 1 139
℃ 2 m in ， 30 个循 环 ； 72 ℃ 5 m in 。
根据验证 得 到 的 基 因 片 段 ， 设 计 嵌 套 引 物 G S P 3 (5 ’一 A C C C T G T G G lTrA lTrC T A T G A ．3 ’) 和 G S P 4
(5 ’． C C T G G T V G A G A G G G T G C T I

G 一 3 ’)。 以 3 ’ 锚 定 引 物 (5 ’． C T G A T C T A G A G G T A C C G G A T C C - 3 ’) 和
G S P 3 、 G S P 4 为引物组 合 ， 以混 合 cD N A 为模板 ， 进行嵌套 P C R ， 扩增转录产物 的 3 ’末端 。 P C R 反 应
条件 ： 94 qC 预变性 5 ra in ； 94 ℃ 30 S ， 58 oc 30 S ， 72 ℃ 2 m in ， 30 个循环 ； 72 cc 5 m in 。 以 5 ’ 锚定
引物和基 因特异性 引物 G S P 5 (5 ’． A cT G T G cC r兀 T G T G A G A ． 3 ’) 和 G S P 6 (5 ’一 G C A A A A G C A G G A A G T A G ．
T A A A A G 一 3 ’ ) 为引物组 合进 行嵌 套 P C R ， 扩 增 转 录 产 物 的 5 ’末 端 。 P C R 反 应 条件 为 ： 94 ℃ 预 变 性
5 ra in ； 94
oC 30 S ， 58 qC 30 S ， 72 ℃ l ra in ， 30 个循 环 ； 72 ℃ 5 ra in 。 P C R 产物经 回收 、 纯 化 ， 与
pG E M — T E asy载体 (P rom ega 公 司 ) 连 接 ， 转 化 D H 5 a 感 受 态 细 胞 ， 蓝 白斑 筛选 后 ， 进 行 序列 测 定
(三 博远 志公 司 )。 用 D NA M A N 软件组 装 以 上 序列 ， 获得全 长 cD NA 。 利用 C lustalX 1 ． 8软件进行多序
列对 齐和排序 ， 用 G en D O C 软件检测输 出同源 比对结果 ， 利用 D N A S tar 软件构建 S A M D C 进化树 。
1 ． 4 S IS M A D C l基 因组 序 列及 其上 游调 控序 列 的克隆
根据转 录起始位点下 游序列 和 P oly (A ) 上 游 序列设 计 引物 G S P 7 (5 ’． cT cA C C A C A A lTrC T G T G T —
T A A A C 一 3 ’) 和 G S P 8 (5 ’一 A C T C A A A A C A A A cA cA C T rr一 3 ’)， 以 G S P 7 + G S P 6 、 G S P 8 + G S P l 为弓I物组
合 ， 分别扩增 S 1S A M D C l基 因组 序列 5 ’和 3 ’端 。 P C R 反 应条件 ： 94 cc预 变性 5 m in ； 94 oC 30 S ， 55
℃ 30 S ， 72
oC (5 ’端 3 m in ， 3 ’端 90 S )， 30 个循环 ； 72 ℃ 5 m in 。 利用 本实验室 改 良的双链介导染色
体步移 技 术 扩 增 S IS M A D C l 基 因 的 上 游 调 控 序 列 (刘 志 勇 ， 2007 )。 顺 式 元 件 分 析 用 P L A C E
(http： ／／w w w ． dna． affrc． go ． ip／P L A C E ／) 来完成 。
1 ． 5 S IS M A D C l在不 同番茄器 官 中的表达
根据 获得 的 全 长 序列 ， 设 计 引物 G S P 9 (5 ’ 一 A T C A C G A A G A T C C T ccC C A A ． 3 ’) 和 G S P l0 (5 ’． A C —
G A C C C T C A A G A C A A C A C T - 3 ’ )， 以 卢一 A ctin 为内标基 因 ， 分别在 番茄根 、 茎 、 叶 、 花 蕾 、 幼果 等器 官
的 cD N A 中进行半定量 R T - P C R 扩增 ， 检测 S IS M A D C l在番茄不 同器官 中的表达 。 P C R 反 应程 序 ： 94
℃ 预 变性 3 m in ； 94 ℃ 30 s ， 58 ℃ 30 s ， 72 ℃ 1 m in ， 25 个循环 ； 72 ℃ 5 ra in ， 反应完毕后取 lO 斗L
于 1 ． 5 ％ 的琼脂糖凝胶上 进行 电泳 分析 。
2 结果 与分析
2． 1 番茄 S IS A M D C l基 因 cD N A 和 D N A 序 列 的
获得
以 E G 364 952 为种 子 序 列 ， 在 番 茄 E S T 库 中
进行 电子延 伸 ， 最 终得 到 1 个长 为 1 955 bp 的拼
接序列 。 根 据 电子 延 伸结 果 ， 设 计 引 物 G S P l 和
G S P 2 ， 以混 合 cD NA 为模板进 行 P C R 扩增 ， 获得
1 条约 l600 bp 的条带 (图 1 )。 该扩增 片段 受信
息探针的完全支持 ， 证 明电子延 伸结果是正 确 的 。
通过 3 ’一 R A C E 和 5 ’ R A C E ， 分别获得 了约 500 bp 、
600 bp 的扩增产物 (图 1 )， 测序表 明它们分别是
所 克隆基 因的 3 ’端和 5 ’端 。
将 以 上 序列拼接 ， 获得 1 84 7 bp 的全 长cD N A
序列 (图 2 )。 经 O R F 搜 索 以 及 其 它 植 物 来 源
S A M D C 基 因比对分析 ， 确定该基 因编码 3 个 O R F ，
bp
l600 ． ． ． 一
6【)0 — ?
4 00 ． ． ． 一
hI 1 2 3 4
图 1 S IS A M D C l cD N A 扩增 结果
M ： M arker 2000 ； 1 ： H ， O ； 2 ： 5
’
． R A C E ；
3 ： G S P I 和 G S P 2 扩增结果 ； 4 ： 3 ’ R A C E 。
F ig． 1 A m plification ofS IS A M D C I cD N A sequence
M ： M arker 2000 ； 1 ： H ， O ； 2 ： 5
’
． R A C E ：
3 ： R T — P C R w ith G S P I and G S P2 ： 4 ： 3
’
一 R A C E ．
维普资讯 http://www.cqvip.com
1 14 0 园 艺 学 报 35 卷
依次为微型上 游 O R F (tiny upstream O R F ， ti— uO R F )、 小型上 游 O R F (sm allupstream O R F 。 sm — uO R F )
以及主 O R F (m ain O R F )， 分别出现在转录本的 + 162 bp ～ + 170 bp 、 + 170 bp ～ + 325 bp， + 524 bp
～ + 1 606 bp 位置 ， 5 ’一 U T R 和 3 ’一 U T R 分别长 523 bp、 24 1 bp。 ti— uO R F 和 sm ． uO R F 存在 一 个碱基 的重
叠 ， 即前者终止 密码 子 T A A 最 后 一 个碱基 A 同时是后 者起 始密码 子 A T G 的第 一 个 碱基 。 m ain O R F
起始密码 子 A T G 上 游 一 3 位核苷酸为 A ， + 4 位为 G ， 是 一 个典型 的 K ozaK 结构 。 m ain O R F 编码 360
个氨基酸酶原 ， 与番茄 已 克隆的两 个 S A M D C (B T 013281 和 B T 013882 ) 同源性 分别 为 66％ 和 77％ 。
因此推定得到了番茄 S A M D C 基 因家族 一 个新成员 的全长 cD N A 序列 ， 命名为 S IS A M D C l， G enB ank登
录号 ： E F 550528。
A T G A T C T 从 T G G A G T C A A A A G G T G G T A A A A A G A A G T C T A G T A G T A G T A G T T C C T T A T T T T ^ C G A A G C T C C C C T C G G C T A C A
M l M E S K G G K K K S S S S S S L F Y E A P L G Y
G C A T T G A A G A C G T T C G A C C A A A C G G C G G A G T G A A G A A G T T C A G A T C A G C T G C T T A C T C C A A C T G C G C G C G C A A A C C A T C C T
S I E D V R P N G G V K ＆ F R S A ^ y S N C A R K P S
G A T A T T C C C T A A A C T T C C T T C C T T A A A G C G T C A A T A G A C G C A A C C A A A A A A A A A A A C A A A A A A A T A A T T T C T G C T T T C A G T
T C T T C T T T T G T A A A A C C C T C A C T C A C T A C T T C C T G C T T T T G C A C T C A T T G C T T T G A A C A T T T T C
C G C T T T A A C T T C C T T T G C T G T T G T G A A C T T T T T C A T A A T G G A A A T G G A C T T G C C A G T T T C T G C C A T T G G T T T T G A A G G T T T
M E M D L P V S A I G F E G F
C G A A A A G A G G C T C G A A A T T T C T T T C G T C G A G C C T G G T C T G T T T G C T G A T C C T A A l
’
G G A A A A G G A C T T C G A T C T C T C A C A A A
E K R L E I S F V E P G L F A D P N G K G L R S L T K
G G C A C A G T T G G A T G A A A T T C T C G G A C C T G C T G A G T G C A C C A T T G T T G A T A A C C T G T C A A A T G A C T A T G T T G A T T C C T A T G T
A 0 L D E l L G P A E C T l v D N L S N D Y V D S g0 蘩
G C T G T ℃C G A G T C ~
、
A G C C T C T T C G T T T A T T C JrT A C A A G A T A A T C A T C A A A A C A T 6T G G T A C C A C A A A G C T G C T T C T T 6C A A T
iL sB llS0isiL F V Y S y K I l I K T C G T T K L L L A l
T C C G C C C A T T C T G A G G T T G G C T G A G A C C T T G T C T C T C A A A G T A C A A G A C G T G A G G T A T A C C C G T G G G A G C T T C A T T T T C C C
P P I L R L A E T L S L K V O D V R Y T R G S F l F P
T G G T G C T C A A T C G T T T C C T C A C C G C C A C T T T T C T G A A G A A G T T G C T G T C C T C G A T G G A T A T T T T G G A A A G C T T G C T G C C G G
G A O S F P H R H F S E E V A V L D G Y F G K L A A G
T A G C A A G G C T G T G A T T A T G G G ^ A A T C C C G A C A A A A C A C A G A A A T G G C A T G T C T A C T C T G C C T C A G C T G G C A C T G T T C A G T G
S K A V I M G N P D K T O K w H V Y S A S A G T V Q C
T A A T G A C C C T G T T T A C A C T C T T G A G A T G T G T A T G A C T G G T T T G A A C A G G G A G A A G G C A T C T G T C T T C T A C A A A A C T G A A G A
N D P V Y T L E M C M T G L N R E K A S V F Y K T E E
A A G T T C G G C T G C T C A C A T G A C T G T T A G A T C T G G C A T C A G G A A G A T C C T C C C C A A G T C T G A G A T A T G T G A T T T
‘
rG A G T T T G A
S S A A H M T V R S G l R K l L P K S E l C D F E F E
A C C C T G T G G T T A T T C T A T G A A T T C T A T T G A A G G A G C T G C T G T T T C A A C C A T T C A C A T T A C C C C G G A G G A C G G C T T T A G C T A
P C G Y S M N S I E G A A V S T I H l T P E D G F S Y
T G C C A G C T T T G A A T C T G T T G G A T A T G A T C C T A A A A C C A A T G A G T T G G G T C CC C T G G T T G A G A G G G T G C T T G C A T G T T T T G A
A S F E S V G Y D P K T N E L G P L V E R V L A C F E
G C C A G C T G A G T T C T C T A T T G C T C T G C A T G C T G A T G T T G C T A C C A A G T T ^ C T G G A G C A T G T T T G C T C T G T T G A T G T T A A G G G
P A E F S i A L H A D V A T K L L E H V C S V D V K G
C T ^ C T C T C T T G C T G A G T G G A G T C C A G A A G A G T T T G G C A A A G G C G G T T C C A T T G T C T A C C A G A A G T T C A C T A G A A C T C C T T A
Y S L A E W S P E E F G K G G S 1 V Y Q K F T R T P Y
C T G T G A A T C T C C C A A G T C C G T T C T G A A G G G C T G C T G G A A G G A G G A A G A G A A A G A A G G A A A G G A G T A G
C E S P K S V L K G C W K E E E K E G K E
图 2 S IS A M D C l cD N A 序 列及 推导 的氨基 酸序 列
起始和终止 密码 子 以黑 体表示 ； 阴影部分为酶 原 剪切 位点保守序列 ； 下划线部分为 P E S T 结构域 。
F ig． 2 N ueleotide sequence ofS IS A M D C l eD N A and deduced am in0 acid sequ ence
Initiation codons and stop codons are bolded； S haded fram e indicates conserved sequ ence w ith
the proenzym e cleavage site ； P E S T m otifis underlined．
维普资讯 http://www.cqvip.com
8期 刘 志勇等 ： 番 茄 S 一 腺苷蛋氨酸脱羧酶基 因 S IS A M D C l的克隆与序列 分析
基 因组 扩增分别得 到约 2 200 bp 和 1 4 00 bp
的条带 ， 拼接后得到全长序列 3 64 8 bp (图 3 )。 ．
分析 发 现 ， S IS A M D C l存 在 3 个 内含 子 (将
转录起 始位点 C 定 义 为 + 1 位 )， 分别 位 于 + 9 1 j
0
20
0
：=
bp 一 十 195 bp (内含子 1 )， + 263 bp ～ + l85 0 bp
(内含子 2 )， + 1 998 bp 一 十 2 105 bp (内含 子
3 )。 内含 子 一 外 显 子 边 界 均 符 合 “ G T - A G ” 规
则 。 内含子 1 和 内含子 2 位于 ti- uO R F 的上 游 区
域 ， 内含子 3 位于 sm — u0 R F 内 。 m ain 0 R F 以 及下
图 3 s泓 肋 cl基 因组 扩增 结果
游区域没 有 内含子 存在 ， 符合植 物 S A M D C 基 因 M ： D N A 。 。rk。，； 1 ： 5 ， 端扩增结 果 ；
的基 因组 结 构特点 (F ranceschettiet a1． ， 2001 )。 2 ： 3 ， 端扩增结 果 。
S IS A M D C l第 2 个 内含子 内散布着多个 重 复序列 ， F ig． 3 A m plification ofS IS A M D C I genom ic sequence
如 + 582 bp、 + 668 bp 分别存在 一 个 86 bp 的直接 M ： D N A m arker； l： 5
’
segm ent；
重复序列 ， + 35 2 bp 、 + 4 97 bp 处 分别存在 一 个 幺
’ ” gm ” 。
13 bp 正 向重复序列 (T G ‘ITrG A T A T G A T T )， + 4 38 bp 和 + 759 bp 处 的 11 bp 的重 复 (1_IT 兀TrC rITITITI’)
以及 + 276 bp、 + 5 15 bp 处存在的 12 bp 的镜像重复序列 (A T G T I

G T IT F C G ) 等 。
2． 2 S IS A M D C l基 因编码产物 的功能分析 与 同源 比较
S IS A M D C I m ain O R F 编码 360 个氨基 酸 的 S A M D C 酶原 (pI 5 ． 03 )， 预测分子量 约为 39 kD 。 推导
的氨基 酸 序 列 包 含 两 个 S A M D C 保 守 结 构 域 ： 酶 原 剪 切 位点 (L S E S S L F ) 结 构 域 (S tanley et a1． ，
1989 )、 与 S A M D C 蛋 白快速 降解有关 的 P E S T (T IH IT P E D G F S Y A S F E ) 结构域 (R ogers et a1． ， 1986 )。
在酶原剪切 位点剪切 可形成较长的 O f． 亚 基 (c 一 末端 ) 和较短 的 B 亚 基 (N 一 末端 )。 人体 S A M D C 催
化功能所必 需 的氨基 酸 G lu 。 、 G lu “ 、 S er矾 、 C ys
跎
、 S er
。。。和 H is。。。在 S IS A M D C l中高度保守 (图 4 )。
多重序列 比对 表 明 (图 4 )， 所 有植 物 S A M D C 的 N 一 末 端 保 守性较 强 ， 而 C 一 末 端 的保 守性较
弱 ， 功能结 构域 (酶原剪切位点和 P E S T 结构域 ) 高度保守 ， 显 示 了 S A M D C 酶进化 的保守性 。 相对
于包括番茄在 内的 双 子 叶植 物 ， 单 子 叶植 物 S A M D C (水稻 、 小 麦 ) 拥 有较 长 的 C 一 末 端 ， 但 两 者
C 一 末端均 富含酸性 氨基酸 ， 如谷氨酸 (E )。
S S 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一札札 lllllllllI
；8眦 llllllllll一
1 2 3 4 5 6 7 8 9
∞n抡"
1 2 3 4 5 6 7 8 9
加n挖n
～
维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯 http://www.cqvip.com
8期 刘 志勇等 ： 番茄 S 一 腺苷蛋氨酸脱羧酶基 因 S IS A M D C l的克隆与序列分析
S IS A M D C l推 导 的 氨基 酸 序列 与 已 知 植 物 S A M D C 同源 性 较 高 ， 与马 铃 薯 (Z 1 1680 )、 蔓 陀 罗
(Y 07768)、 水稻 (Y 07766) 和 玉 米 (Y 07767 ) 的 同源 性 分别为 96％ 、 94 ％ 、 50％ 和 4 8％ ， 与另外
两个番茄 S A M D C 基 因 (B T 013281 和 B T 013882 ) 的相似性分别为 66％ 和 77 ％ ， 但与人 、 酵母 的相似
性分别只有 30％ 、 25 ％ 。 S IS A M D C l sm ． uO R F 的编码 产物 (5 1 个 氨基 酸 ) 与其它植物 高度保守 ， 如
与玉 米 (Y 07767 ) 和水稻 (Y 07766 ) 的同源性分别达 到 85 ％ 和 83 ％ ， 与 B T 013281 、 B T 013882 的同
源性分别为 87％ 、 85 ％ ， uO R F 的高度保守 暗示 在 S A M D C 基 因的表达 调 控 中可 能起 重要 作用 。 基 于
酶原氨基酸序列 的系统进化树表明 ： 氨基酸 的进化与植物的进化保持 一 致 ， 同科植物在进化树上基本
处于 同一 分支 。 S IS A M D C l与 马 铃 薯 (Z 1 168)、 蔓 陀 罗 (Y 07768)、 烟草 (A F 033 100 ) 以 及 长 春花
(U 12573 ) 具有更近 的亲缘关系 (图 5 )。
80
100次 自展 分析碱基 替换值
N ucleotide substitutions(× 100)
圈 5 番 茄 S IS A M D C I 氨 基酸 序 列 与不 同来 源 S A M D C 氨基 酸序 列 的 系统进 化树
F ig． 5 P hylogcnetic tree ofS A M D C s from various species including S IS A M D C l
2． 3 S IS A M D C l基 因上 游调控 区序 列分析
利用染色体步移技术 ， 克隆了 S IS A M D C l转录起始位点上 游 879 bp 序列 (图 6 )。 分析表 明 ， 在
转录起始位点上 游存在多个顺式调控元 件 ， 其 中 一 55 ～ 一 5 l位存在 一 个 C A A T ． box (C C A A T C )， 一 33
一 一 27 位存在 T A T A - box (T A T A A A T )， - 4 27 ～ - 4 05 和 ⋯ 398 376 处存在 23 bp 的重复序列 ， 分
别含有 1 个 W ． box (T G A C T ) 序列 。
一一
一
一一一一一
一
一一一一一一一一
维普资讯 http://www.cqvip.com
1 14 4 园 艺 学 报 35 卷
G A T C A C A T G A C G T A 舭 T
’
丌 A A T T M A A A T C A C T A A A A C T C G A C _rT A A C t、A I
、
A qA 。F C A A T A A T T T T T T A q、T T A T C A q、G A A A A A q、A
T C T T A A (：A A A (jG G A G T A G T T A C G C A ^ ^ T C T C T A A C C ^ C A G G A C ^ A A G C A C A C A 丁^ T G A T C (；A T A ^ T G A T A C T T A T ^ A A T T T T A T
T T A G A C A C T C A A A T A A T A A A A

I‘A T G T C T A T T A G A T T T T T G T A C A T A T T A T T G A A T A T C T A T T ^ C ^ A A A A C A A A C A A A T T A A T T C
A T T A A A A T A C A T T A T G T T T M A ^ T T A T A T G T A T T A C T T A T T C A C C T C ^ A T A A ^ C C G T A A A A T C C T A T A C A T A T T 丌 A A A C T C A A
A A C A T G G T C A T ^ ^ C T ^ T G T l^A A C A A C A T A A T A C G A T A A T A T T C A T C T T A A T T T A T A A T T T A A C T A T G A T A T T A A T C T A G A C T A T
羹A A cT A T ^ A cT cA A T A ^ T T A G cA ^ T G A A T cA T G A A T A T A T T T T T cA A G T T G G A A A A ^ ^ A A A T T A G A T T A T T A A ccA T T T T T A c
A T A ^ A A A G A A A T A T A T G A A A A A _rT T T C A A C A A C 2
、
T T T A A A T T T C T T A A T A
’
I
’G G A A T 。rA A A T q’ A A A l’A T A A G G T C A C T T G C G G T A
A A T A A A T A A ^ T T T T T A T T T T A A T A A G A C T C C T A G T C A T A (；C C A C A T A C C T A C C (；T rrT G T C G A T A T C T A A G G G T A A T A T C G T C A
T T T T A A T A T G T G G G cG A A A ^ T T ccA cG cA A G T A T A G G G A cT T ^ A ^ T G T A A T T A ^ A cG A A A A ^ T A c^ G G G A 匪ijjiihT G A T A T
C 。FC A G C A T A T A 王蚺 A T A G C C A A C T
。YG C T G C C T C T C A G A A A C G C
’
FC A C G A G A A T T C T G
图 6 S IS A M D C l转 录起始 位 点上 游调 控序 列
阴影 部分为 23 bp 的重 复序列 ； 阴影 内方框为 W — box ；
下划线处 为 T A T A — box ； 方框处 为 C A A T ． box ； 黑体 c 为转 录起始位点 。
F ig． 6 U pstream regulatory sequen ce from the transcription i~tiation site
S hades indicate 23 bp repeated sequence ． S haded fram es are W — boxes． T A T A — box is u nderlined
and fram e indicates C A A T — box ； T ran scription in itiation site C is in bold．
2． 4 S IS A M D C l基 因在不 同器 官 中的表达
分别提取根 、 茎 、 叶 、 花蕾 、 幼果 的 R N A 进 行半定 量 R T — P C R (图 7 )， 分析 S IS A M D C l在不 同
器官 中的表达模式 。 结果表明 ， S IS A M D C l基 因在番茄 以上 器 官或组 织 中均表 达 ， 但果 实 中的表达量
稍高 。
3 讨论
S l＆4 M D C l
4 cr加
2 3 4
图 7 S IS A M D C l在不 同番 茄器官中的表达
1 ： 根 ； 2 ： 茎 ； 3 ： 叶 ； 4 ： 花蕾 ； 5 ： 果实 。
F ig． 7 R T - P C R analysis ofthe expression ofS IS A M D C l in diferentorgans
1 ： R oot； 2 ： S tem ； 3 ： L eaf； 4 ： B ud； 5 ： F ru it．
多胺是植 物生 长发育的调 节物质 ， 并且 与植 物抗 逆性 相关 。 S A M D C 是 多胺合成代谢 的 一 个 关键
酶 ， 直接影 响亚 精胺 和精胺 的合成 ， 同时反 应底物 S A M 也 是 乙烯合成 的前体 。 S A M D C 将多胺代谢 和
乙烯代谢联 系在 一 起 。 在番茄果实 中高水平表达酵母 S A M D C 基 因 ， 转基 因果 实番茄红 素提 高 了 2 ～ 3
倍 ， 果 汁品质 明显 提高 (M ehta et a1． ， 2002)。 热胁 迫下 ， 耐热番茄 品种总能保持较 高水平 的精胺 和
亚 精胺 (杜永臣 等 ， 2003 )。 S ong 等 (2002 ) 研 究 发 现 ， 如 果 用 专性 抑 制剂 降低 花 粉 萌发 过 程 中
S A M D C 活性 ， 离体花粉 的萌发率也 随之 下 降 ， 用 外源 精胺 和 亚 精胺 处理 可 以部 分缓解 高温胁 迫对 离
体花粉萌发 的抑制作用 。 但 S A M D C 编码 基 因信息 的缺乏 ， 影 响 了对 番茄多胺代谢尤其是精胺和 亚 精
胺合成代谢 的进 一 步研究 。
本研 究将 同源筛选 、 电子延伸和传统 R A C E 、 R T — P C R 相结合 ， 快速分离到 了 一 个 番茄 S A M D C 基
因家族新成员 S IS A M D C l， 从而将番茄 中发现 的编码 S A M D C 的基 因数增 加到 3 个 。 S IS A M D C l具 有植
物 S A M D C 典型 的基 因结构特点 ， 如酶原 剪切位点保守序列 、 与蛋 白快速 降解有关 的 P E S T 结构域 和
维普资讯 http://www.cqvip.com
8期 刘志勇等：番茄 S一腺苷蛋氨酸脱羧酶基因 S1SAMDC1的克隆与序列分析
催化功能必需氨基酸，说明所克隆的 SISAMDC1基因是具有生物学功能的。PEST序列是一个富含
Pro、Glu、Ser和Thr的结构域，在胞内半衰期短于2 h的真核蛋白氨基酸序列中常包含此结构域，而
在胞间半衰期长于20 h的真核蛋白氨基酸序列中则很少出现此基序 (Rogers et a1．，1986；Rechsteiner
et a1．，1987)。因此，PEST结构的存在可能导致 SAMDC的半衰期较短，从而可以快速调控 SAMDC
的活性，以适应细胞对多胺需求的变化。上游调控序列中，除 CAAT—box、TATA—box等常见启动子顺
式调控元件外，还存在串联的W—box。很多与植物防卫反应有关的基因启动子中都有 W—box存在，一
般成簇或分散分布，以镜像或顺式排列 (Yang&Chen，2001)。转录因子 WRKY可以特异性地和 w—
box结合，启动抗逆基因的表达，调控抗逆反应。W—box的存在暗示 SISAMDC1可能接受转录因子
WRKY的直接调控，参与番茄的抗逆反应。
植物SAMDC编码基因一般有3个内含子，均位于 main ORF的上游，内含子位置相对固定 (尽
管在内含子的长度上存在较高的变异)。在番茄中，3个家族成员都有 3个内含子，前两个内含子存
在于 ti—uORF上游，内含子3位于 sm—uORF中。内含子对于基因的转录调控有重要的影响。康乃馨
SAMDC基因成员 CSDC9第一个的内含子对该基因在花粉中的表达是必须的 (Kim et a1．，2004)。
SISAMDC1基因5，_UTR中的内含子是否具有同样的效应，需要进一步的研究。
真核生物 uORF在基因翻译水平上的调控具有重要作用，大多含有 uORF的基因属于调节基因。
多胺合成代谢的关键酶精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、SAMDC、以及亚精胺合成酶都含有 uORF
(Kwak&Lee，2001；金勇丰 等，2004)。植物 SAMDC基因5 一UTR中含有两个 uORF(ti—ORF和 sm—
ORF)，并且两个 ORF有 1个碱基的重叠，但这种重叠结构对于基因表达的影响尚不清楚。植物
SAMDC基因具有非常保守的sm—ORF，其编码产物含有49～54个氨基酸，同源性高达 75％ ～100％，
显著高于植物 SAMDC酶原之间的同源性 (Francescheti et a1．，2001)。Hanfrey等 (2002)发现，植
物 uORF对 main ORF的翻译起抑制作用，从而维持细胞内多胺的代谢平衡。
本研究同时发现，相对于其它器官，SISAMDC1在果实中的表达量稍高，暗示了 SAMDC有可能
在番茄果实发育中起重要的作用。SISAMDC1的克隆将为进一步研究多胺在番茄抗逆、果实发育中的
作用奠定基础。
References
Bouchereau A，Aziz A，Larher F，Martin-Tanguy J．1999．Polyamines and environmental challenges：Recent development．Plant Science，140
(2)：103—125．
Du Yong-chen，Mao Sheng-li，Wang Xiao-xuan，Zhu De-wei，Li Shu-de，Dai Shan—shu，Gao Zhen—hua．2003．The diferent changes of endoge-
nous polyamines in tomato plants with diferent heat-tolerance under high temperatures．Acta Horticulturae Sinica，30(3)：28l一286．(in
Chinese)
杜永臣，毛胜利，王孝宣，朱德蔚。李树德，戴善书，高振华．2003．高温胁迫下耐热性不同番茄多胺水平变化的差异．园艺学
报，30(3)：281—286．
Fos M，Proafio K，Alabadt D，Nuez F，Carbonell J．Garcla-Martlnez J L．2003．Polyamine metabolism is altered in unpollinated parthenocarpic
pat-2 tomato ovaries．Plant Physiology，13 l(1)：359-366．
Franceschetti M．Ha~rey C，Scaramagli S．Torrigiani P，Bagni N，Burtin D．Michael A J．2001． Characterization of monocot and dicot plant
S-adenosyl-l-methionine decarboxylase gene families including identification in the mRNA of a highly conserved pair of upstream overlapping
open reading fram es．The Biochemical Journal，353：403—409．
Galston A W，Sawhney R K．1990．Polyamines in plant physiology．Plant Physiology．94 (2)： 406-410．
Hanfrey C，Franceschetti M ，Mayer M J，lllingworth C，Michael A J．2002．Abrogation of upstream open reading flame—mediated translational
control of a plant S-adenosylmethionine decarboxylase results in polyamine disruption and growth perturbations．The Journal of Biological
Chemist~，277(46)：4413l一4139．
Hao Y J，Zhang Z，Kitashiba H，Honda C，Ubi B，Kita M，Mofiguehi T．2005．Molecular cloning and functional characterization of two apple
维普资讯 http://www.cqvip.com
1146 园 艺 学 报 35卷
S-adenosylmethionine decarboxylase genes and their different expression in fruit development，cell growth and stress responses．Gene，350
(1)：4l一50
Hu Wen-wei．Gong Hai-biao，Pua Eng-chong．2005．Molecular cloning and characterization of S-adenosyl-methionine decarboxylase genes from
mustard(Brassica juncea)．Physiologia Plantarum，124：25—40．
Huang Ji，Wang Jian—fei，Zhang Hong-sheng，Cao Ya-jun，Lin Chang—fa，Wang Dong，Yang Jin-shui．2002．In silico cloning of -6-phos-
phate dehydrogenase cDNA fromrice(Oryza sativa L．)．Acta Genetica Sinica，29(11)：1012—1016．(in Chinese)
黄 骥，王建飞，张红生，曹雅君，林长发，王 东．杨金水．2002．水稻葡萄糖 一6一磷酸脱氢酶cDNA的电子克隆．遗传学
报，29(11)：1012—1016．
Jin Yong—feng，Bian Teng-fei，Zhou Ping．2004．Upstream open reading frames(uORF)analysis of plant mRNAs．Journal of Agricultural Bio-
technology，12(5)：493—499．(in Chinese)
金勇丰，边腾飞，周 萍．2004．高等植物基因上游可译框架 (uORF)的分析．农业生物技术学报，l2(5)：493—499．
Kim Y J．Lee S H．Park K Y．2004．A leader intron and ll5 bp promoter region necessary for expression of the carnation S-adenosylmethionine
decarboxylase gene in the polen of transgenic tobacco．FEBS Leters，578(3)：229—235．
Kurepa J，Smalle J，Van Montagu M，Inz D．1998．Polyamines and paraquat toxicity in Arabidops~thaliana．Plant＆Cel Physiology，39(9)：
987—992．
Kwak S H，Lee S H．2001．The regulation of ornithine decarboxylase gene expression by SUCrose and small upstream open reading fram e in tomato
(Lycopersicon esculentum Mil1．)．Plant＆Cel Physiology，42(3)：314—323．
IJj Z Y．Chen S Y．2000．Diferential accumulation of the S-adenosylmethionine decarboxylase transcript in rice seedlings in response to salt and
drought stresses．Theoretical and Applied Genetics，100 (5)：782—788．
Liu Zhi-yong．Analysis of polyamine metabolism and diferentially expressed genes in tomato(Solanum lycopersicum)under heat stres[Ph．D．
Dissertation]．Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences．(in Chinese)
刘志勇．2007．热胁迫下番茄多胺代谢与基因差异表达分析 【博士论文]．北京：中国农业科学院．
Mehta R A，Casml T，Li N，Ali N，Handa A K，Mattoo A K．2002．Engineered polyam ine accumulation in tomato enhances phytonutrient con—
tent，juice quality and vine life．Nature Biotechnology，20(6)：613—618．
Rechsteiner M，Rogers S，Rote K．1987．Protein structure an d intracellular stability．Trends in Biochemical Sciences，12：390—394．
Rogers S，Wells R．Rechsteiner M．1986． Amino acid sequences common to rapid degraded proteins：Th e PEsT hypotheis．Science，234
(4774)：364—368．
Shen W，Nada K，Tachibana S．2000．Involvement of polyamines in the chiling tolerance of cucumber cuhivars．Plant Physiology，124 (1)：
43l一439．
Song J J，Nada K，Tachibana S．2002．Suppression of S-adenosylmethionine decarboxylase activity is a major cause for high-temperature inhibition
of pollen germination and tube growth in tomato(Lycopersicon esculentum Mil1．)．Plant＆Cell Physiology，43(6)：619—627．
Stanley B A，Pegg A E，Holm I． 1989． Site of pyrnvate form ation and processing of mammalian S-aden0sylmethi0nine decarboxylase proenzyme．
The Journal of Biological Chemistry，264 (35)：21073—21079．
Taylor M A，MadArif S A，Kumar A，Davies H V，Scobie L A，Pearce S R。Flavel A J．1992．Expression and sequence an alysis of cDNAs
induced during the early stages of tuberisation in different organs of the potato plant(Solanum tuberosum L．)．Plant Molecular Biology，20
(4)：641—651．
Tian A G，Zhao J Y，Zhang J S，Gai J Y，Chen S Y．2004．Genomic characterization of the S-adenosylmethionine decarboxylase genes from soy—
bean．Theoretical and Applied Genetics，108 (5)：842—850．
Wiliamson V M，Ho J Y，Wu F F，Miler N，Kaloshian I．1994．A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene，Mi，in
tomato．Theoretical and Applied Genetics，87：757—763．
Yang P Z．Chen Z X．2001．A family of dispersed repetitive DNA sequences in tobacco contain clusters of W-box elements recognized by patho-
gen-induced WRKY DNA-binding proteins．Plant Science，161(4)：655—664．
维普资讯 http://www.cqvip.com