全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 377 - 380
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 07 - 20; 修回日期 : 2006 - 11 - 23
基金项目 : 福建省与闽籍专家科技合作计划项目 (2003085)
超敏反应辅助蛋白基因 ( h rap) 转化番茄的研究
王水琦 1, 2 , 陈　坚 1, 3 , 林忠平 1
(1 北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室 , 北京 100087; 2 漳州职业技术学院 , 福建漳州 363000;
3 福建省农业科学院 , 福州 350003)
摘 　要 : 将可以诱发植物对病原菌抗性的甜椒 hrap基因置于 35S启动子的驱动下 , 经农杆菌介导引入
番茄。再生植株经过含卡那霉素的培养基的选择 , 后经 PCR 检测和 Southern杂交鉴定含有目标基因。
Northern杂交检测其表达后 , 初步的抗菌检验显示其提高了对青枯病原菌的抵抗力。
关键词 : 番茄 ; 遗传转化
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220377204
Stud ies on Tran sforma tion of h rap Gene in to Toma to
WANG Shui2qi1, 2 , CHEN J ian1, 3 , and L IN Zhong2p ing1
(1 The N ationa l Key Laboratory of Protein Engineering and Plan t Genetic Engineering, Pek ing U niversity, B eijing 100087,
China; 2 Zhangzhou Institu te of Technology, Zhangzhou, Fu jian 363000, Ch ina; 3 Fujian A cadem y of A gricultural Sciences,
Fuzhou 350003, Ch ina)
Abstract: Sweet pepper hrap gene under the control of CaMV 35S p romoter has been transformed into
tomato via A g robacterium tum efaciens mediated p rocedure1 Plantlets were regenerated on MS medium with 310
mg·L - 1 62BA , 012 mg·L - 1 IAA , and 50 mg·L - 1 kanamycin1 The transgenic p lants had been identified by
PCR p rocedure and Southern blot, and their exp ression was showed by Northern hybridization. A p relim inary
assay with leaf disc infected by tomato pathogen R alston ia solanacea rum Sm ith showed that transgenic p lants
had higher resistance to the pathogen than wild2type tomato1
Key words: Tomato; Genetic transformation
植物受病菌侵染时会产生各种防御反应 , 在这些反应中最具有特点的就是超敏反应 (HR )。一
般认为 HR反应是由病原菌诱发 , 使侵染部位植物细胞坏死 , 形成生理障碍 , 限制了供给病菌的营
养 , 阻止病菌进一步传播 ( Goodman & Novacky, 1994; Dangl et al1, 1996)。人们又发现许多革兰氏
阴性病原菌如软腐病菌 ( E rw in ia)、青枯病菌 ( R a lston ia)、假单胞菌 ( Pseudom onas) 等引起敏感植
物发病及抗性植物 HR反应 , 是受这些细菌的 hrp基因簇控制的。这个基因簇编码细菌的一条分泌途
径并将细菌产生的诱导蛋白释放到胞外或宿主细胞中 , hrp缺失型细菌致病力减弱 , 也不能诱导抗性
植物的 HR反应 (Bogdanove et al1, 1996; Grant & Mansfield, 1999)。这些诱导蛋白被称为 harp in蛋
白 , 用它来处理拟南芥悬浮细胞时会诱导其快速产生 H2 O2等抑菌物质以起抗病防御作用 (Desikan et
al. , 1996, 1999)。但 harp in蛋白在宿主细胞中的作用机制仍不清楚。
Chen等 (1998) 在甜椒中发现存在超敏反应辅助蛋白 (HRAP) , 可加强 harp in诱导的植物 HR
反应。而后通过转化试验 , 发现表达甜椒 h rap基因的烟草对细菌的 harp in蛋白更敏感 , 并对其病原
菌丁香假单胞菌和软腐病菌具有抗性 ( Ger et al1, 2002)。为了利用这种源于植物的抗病蛋白培育更
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
多的抗病性作物 , 将甜椒 hrap基因置于 35S启动子的驱动之下转化番茄 , 并拟在苗期就用具有释放
harp in蛋白能力的病原青枯菌快速检测转化苗的抗菌能力 , 以期获得具有表达能力的转基因番茄 , 进
行更深入的抗病性研究。
1　材料与方法
番茄 (Lycopersicon esculentum M ill1) ‘中蔬 4号’种子购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ; 质粒
pB IHRAP (图 1) 由台湾中央研究院冯腾永教授提供。所用培养基 SM1 : MS + 62BA 310 mg·L - 1 + IAA
012 mg·L - 1 ; SM2 : SM1 +羧苄青霉素 500 mg·L - 1 ; SM3 : SM1 +羧苄青霉素 500 mg·L - 1 +卡那霉素
50 mg·L - 1 ; RM: 1 /2MS + IAA 013 mg·L - 1 +羧苄青霉素 500 mg·L - 1 +卡那霉素 50 mg·L - 1。
图 1　pB IHRAP的质粒结构
F ig. 1　Pla sm id structure of pB IHRAP
番茄种子用 45℃温水浸泡 5～6 h, 75%酒精浸泡 30 s, 40%次氯酸钠表面处理 30 m in, 无菌水冲洗
5～7次 , 滤纸吸干后接种在 1 /2MS培养基上 , 25～28℃培养 7～10 d (2 000 lx光强 , 16 h·d - 1 ) , 子叶
完全展开时用于转化。同时将含 pB IHRAP的农杆菌 LBA4404单菌落接种到含链霉素 100 mg·L - 1、利福
平 50 mg·L - 1和卡那霉素 50 mg·L - 1的 20 mL液体 LB培养基中 , 28℃恒温摇床振荡培养 30 h至对数生
长期 , 按 1∶50加到 LB上再摇 4～6 h, 取适量用液体 MS培养基稀释 20倍后用于侵染。
农杆菌对番茄的侵染用叶盘法 (王关林和方宏筠 , 2002) 并适当改进。子叶切片后接种于 SM1
中 , 预培养 2 d。将制备好的侵染农杆菌液浸泡预培养 2 d的子叶叶盘充分浸润 20 m in。用无菌纸将
叶盘适当吸干 , 转入 SM1进行暗培养 , 2 d后转接到脱菌培养基 SM2中 , 2 000 lx光强 , 16 h·d - 1 ,
25℃条件下培养 7 d, 后转接于筛选培养基 SM3中 , 每 14 d转接 1次。当抗性芽长至 115～210 cm时 ,
将其切下并剔净基部附着的愈伤组织 , 转入生根培养基 RM进行生根培养。
再生番茄基因组 DNA采用 SDS法微量提取 (王关林和方宏筠 , 2002)。以质粒 pB IHRAP作阳性
对照 , 用专一引物 HRAPs ( 5′CGCGGATCCATGAAAATGAAGAACCTCTC3′) 及 HRAP748a ( 5′GTTG2
GAGTTGGAGGACGAGG3′) 进行 PCR分析。杂交检测参照 Sambrook和 Russell ( 2002 ) 的方法 : 用
B am H I限制性内切酶 ( Promega公司 ) 酶切番茄基因组 DNA , 完全切开后 , 电泳转膜至尼龙膜进行
Southern杂交 ; 植株的总 RNA用 TR Izol ( Invitrogen公司 ) 提取 , 在 1%甲醛变性胶上电泳 , 转尼龙
膜 , Northern杂交。杂交带显色及探针制备按 PCR D IG Labeling M ix (Roche公司 ) 使用说明进行。
番茄青枯菌引自福建省农业科学院 , 在 TZC (2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑选择性培养基 ) 固体
培养基上划线培养 , 挑取一个红色的单菌落于 20 mL的 TZC液体培养基中 28℃振荡培养 16 h。每 100
mL的 MS培养基加入 1 mL菌液 , 制成带菌的 MS固体培养基。分别剪取组培再生番茄的茎段与叶片
接入培养基中培养 , 36 h后观察叶片对病菌的抗菌效果。
2　结果与分析
211　番茄叶盘的转化及再生
叶盘经浸菌共培养后转入分化培养基 , 2周后伤口处长出淡黄色愈伤组织 , 不久长出绿色芽点并
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　2期 王水琦等 : 超敏反应辅助蛋白基因 ( hrap) 转化番茄的研究 　
再生出不定芽。不定芽长到 2～3片叶时转入生根
培养基长出新根。待长到 3～5片叶后即可移栽。
212　转化再生番茄的 PCR检测
对获得的 11株生根苗进行 PCR检测 , 有 6株
转基因植株通过 PCR 扩增出与阳性对照 (pB I2
HRAP) 同样大小的 748 bp片段 , 而未转化株则无
特异性扩增条带 , 初步证明 hrap基因已转入番茄
植株的基因组中 , 部分检测结果如图 2。
213　转基因再生植株的 Southern及 Northern杂
交
取 PCR 检测呈阳性的转基因再生植株进行
Southern杂交鉴定 (图 3, A )。从图 3可看出 ,
2、3、4号均检测到杂交带 , 其中 4号有一条带 ,
含有 1个拷贝的目的基因 ; 3号有两条带 , 推测
其基因组中插入 2个拷贝的目的基因 ; 2号有 4
条带 , 推测其基因组中插入 4个拷贝的目的基因。
而作为阴性对照的未转化株 (1号 ) 没有出现杂
交信号 , 这说明 hrap基因已经整合到番茄基因组
中。进一步提取 RNA 进行 Northern杂交 (图 3,
B) , 3号、4号转基因番茄均有较强的杂交信号 ,
而对照无杂交信号 , 证明目的基因已在转录水平
得到了表达。2号株未检测出信号。因为本试验
采用的是地高辛标记 , 灵敏度不如同位素标记 ,
有些转基因植株可能检测不到 , 但从 2号株有多
个拷贝插入来看 , 推测其中 2号株表现为转录后
基因沉默 , 因为转录后的基因沉默可能与重复拷
贝有关 (陈火英 等 , 2006)。
图 2　转 h rap基因番茄再生植株的 PCR鉴定
M: 标准分子量 ; 1～6: 转基因番茄 ;
7, 9: 未转基因番茄 ; 8: pB IHRAP阳性对照。
Fig. 2　PCR identif ication of tomato transformed with hrap gene
M: DNA marker; 1 - 6: Transgenic tomato ; 7, 9: Non2transgenic
tomato; 8: pB IHRAP p lasm id as positive control.
图 3　转化番茄 Southern杂交及 Northern杂交结果
1: 未转基因番茄 ; 2～4: 转基因番茄。
F ig. 3　Results of Southern gel blot and Northern gel blot
of tran sform ed toma to
1: Non2transgenic tomato; 2 - 4: Transgenic tomato.214　转基因番茄对青枯菌抗菌作用的初步鉴定
观察发现 , 1号对照 (未转化番茄 ) 无抑菌圈 , 转基因番茄 2号的抑菌圈较弱 , 但 3号和 4号出
现了明显的抑菌圈 (图 4) , 说明 hrap基因会诱导番茄产生一定的抗菌反应。
图 4　转化番茄茎段 (左 ) 及叶片 (右 ) 抗菌能力的检测
1: 未转化番茄 ; 2～4: 转化番茄。
F ig. 4　An tibacter ia l detection of stem s ( left) and leaves ( r ight) from tran sform ed toma to
1: Non2transformed tomato; 2 - 4: Transformed tomato.
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3　讨论
利用基因工程对作物进行抗病性修饰是极为有效的手段。迄今为止所用的基因有 : ①非植物源的
抗菌蛋白基因 , 一般本身为病菌的毒蛋白 (如抗菌肽、溶菌酶 ) 或能产生抗菌物质的酶 (如 GO 基
因 ) ; ②植物源的病原相关 ( PR ) 基因 , 防御素基因及植物保卫素合成酶基因 , 这些基因表达的蛋白
本身或蛋白的产物一般具有体外抑菌作用 (王关林和方宏筠 , 2002)。
Ger等 (2002) 通过将甜椒 hrap基因转化烟草 , 筛选出了对病原菌丁香假单胞菌和软腐病菌具
有明显抗性的转基因株系。但他们利用原核表达产生的 hrap蛋白证实 : 该蛋白本身对细菌没有毒杀
作用。通过病原菌诱导试验 , 发现被认为是 HR反应标记蛋白的 hsr203J基因相对于非转基因烟草更
快地得到表达。据此他们推断 : 转 h rap基因烟草的抗病性源于诱发了植物体微超敏 (m icro2HR ) 反
应。这种利用植物源蛋白提高植物体本身的抗病反应的基因工程确有其不同的机理。
作者对获得的转基因番茄进行的抗菌检测初步发现了离体茎段和叶片有抗菌作用。但这种作用是
否源于青枯菌的 harp in蛋白更强地诱发了转基因植株的 HR反应 , 只能有待于下一步更深入的研究试
验 , 尤其需对植物体本身作大量的检查才能得出结论。目前仅推测转 hrap基因的番茄能更迅速地释
放出抗菌物质。
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