全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (4) : 895～897
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 09 - 14; 修回日期 : 2005 - 12 - 01
基金项目 : 广东省自然科学基金项目 ( 05005913) ; 广东省高新技术成果 (孵化 ) 项目 ( 98FF32) ; 广东省重大科技专项项目
(2003A2010401)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: ye2lab@ scnu1edu1cn)
金钗石斛花芽 cDNA表达文库的构建及鉴定
庄军平　黄胜琴　潘舒群　叶庆生 3
(华南师范大学生命科学学院 , 广东省植物发育生物工程重点实验室 , 广东广州 510631)
摘 　要 : cDNA文库是分离、筛选基因的重要平台。利用 SMARTTM cDNA library construction技术 , 成功
构建了金钗石斛花芽 cDNA表达文库。结果表明该文库的克隆数为 3102 ×105 pfu, 插入片段的大小在 015～
215 kb范围 , 插入片段的重组率接近 100% , 说明所构建的 cDNA文库质量较好。该文库的构建为克隆与金
钗石斛花芽分化相关功能基因奠定了基础。
关键词 : 金钗石斛 ; 花芽 ; cDNA表达文库
中图分类号 : S 68814　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0420895203
Con struction and Iden tif ica tion of a cD NA Expression L ibrary from
D endrobium nobile
Zhuang Junp ing, Huang Shengqin, Pan Shuqun, and Ye Q ingsheng3
(College of L ife Science, Sou th China N orm al U niversity, Guangdong Key Labora tory of B iotechnology for Plan t D evelopm ent,
Guangzhou, Guangdong 510631, China)
Abstract: A cDNA exp ression library from the flower bud of D endrobium nobile was constructed into
pcDNA310 eukaryotical exp ression p lasm id used SMARTTM cDNA library construction p rotocol. The result
showed that the cDNA exp ression library contained 3102 ×105 pfu, the size of the inserts ranges from 015 kb
to 215 kb, and the percentage of positive clones was almost 100%. A ll of the above mentioned have answered
for the general requirements of a cDNA library. This p rovides a base for cloning of important genes related to
flower bud differentiation in D endrobium nobile.
Key words: D endrobium nobile; Flower bud; cDNA exp ression library
1　目的、材料与方法
金钗石斛 (D endrobium nobile) 为兰科石斛属多年生附生草本植物 , 常作为盆栽供室内观赏 , 也
是良好的切花材料 , 在国际花卉市场占有重要的地位〔1, 2〕。金钗石斛一般需春化处理才能开花〔3〕, 有
关春化诱导花芽分化的机理 , 主要限于模式植物 ———拟南芥等双子叶植物〔4〕, 而对于金钗石斛这样
的单子叶植物则很少有人研究。因此 , 构建金钗石斛花芽 cDNA表达文库 , 对于克隆花芽分化相关基
因 , 进而从分子水平上研究金钗石斛花芽分化机理 , 具有十分重要的理论和实际意义。
取一年生金钗石斛材料 , 种植于华南师范大学兰花中心 , 经 6 /10℃低温处理 40 d后取花芽 ,
- 80℃冰箱中保存以备提取总 RNA。高效表达载体质粒 pcDNA 310购自 Invitrogen公司 ; 试剂和酶
SMARTTM cDNA L ibrary Construction Kit为 Clontech公司产品 ; RNeasy PlantM ini Kit为 Q IAGEN公司产
品 ; 焦碳酸二乙酯 (DEPC) , MOPS, 氨卞青霉素钠盐 , TaqDNA 聚合酶 , 各种限制性内切酶和 T4
DNA L igase均购自上海 Sangon公司 ; 其它试剂为国产分析纯。总 RNA采用 Q IAGEN公司的 RNeasy
PlantM ini Kit提取。
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
金钗石斛花芽 cDNA 的合成及 cDNA 文库的构建 : 按 Clontech 公司 SMARTTM cDNA L ibrary
Construction Kit说明书操作 , 进行第 1链合成 , LD2PCR cDNA扩增 , 酶切消化和柱回收 cDNA。T4
DNA L igase连接上述分别经 S fi I酶切处理好的 pcDNA 3102SfiI载体和 cDNA, 连接产物高效转化
DH5α感受态细胞。转化产物则被分为两部分 , 其中一部分经扩增后作为 cDNA表达文库总库保存于
25%甘油中 , - 80℃冻存 ; 另一部分等分为 100个亚文库 , 经分别扩大培养后同样于 25%甘油中冻
存备用。
cDNA文库克隆数的确定 : 取 1μL dscDNA用于连接反应 , 反应体系 10μL, 转化其中 1μL, 隔
日记数平板的单菌落。取 1 /100, 1 /10和 3 /10体积转化液分别涂板 , 其余用于摇总库菌落 , 隔日记
数平板的单菌落数并计算出克隆数。
重组率的确定 : 步骤同克隆数的确定 , 只是在铺板前向熔化的顶层琼脂中加入 50μL 100 mmol/L
的 IPTG和 50μL 100 mmol/L X2gal, 根据蓝白斑计算重组率。
cDNA文库阳性克隆的检测 : 从转化平板上挑取单菌落 , 接入 Amp +的 015 mL LB培养基中 , 强
烈震荡培养过夜。次日将检测用菌液室温离心 , 10 000 r/m in, 1 m in, 弃上清液 , 收集菌体 , 加入
200μL STE (含 20μg/mL溶菌酶 ) 漂洗菌体 , 充分涡旋以悬浮菌体。将 EP管置沸水中煮 10～15
m in, 至出现白色絮状沉淀。10 000 r/m in室温离心 1 m in。吸取上清液做为 PCR检测样品 , 以 T7和
Sp6为上下游引物 PCR扩增 , 确定插入片段大小。反应体系为 20μL: 10 ×Buffer 2μL, 10 mmol/L
dNTP 1μL, 20μmol/L T7和 Sp6引物各 015μL, 2 U /μL Taq酶 1μL, 015μL样品 ; 扩增程序为 :
94℃变性 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 70 s, 34个循环 , 72℃延伸 10 m in。PCR后于 1%琼脂糖凝胶电泳检
测 PCR结果。
2　结果与分析
211　金钗石斛花芽总 RNA纯度及完整性鉴定
经分光光度计测定 , 提取的金钗石斛花芽总
RNA的 OD260 /OD280为 1186, 这表明本试验所提
取的 RNA无蛋白质污染 ; 所提 RNA经 1%甲醛
变性胶电泳检测结果如图 1所示 , 可见清晰的
28S和 18S两条 rRNA条带 , 且 28S的条带亮度为
18S的两倍 , 这表明所提总 RNA完整性较好。以
上两点综合表明该试验所提取 RNA的纯度和完整
性均较好 , 完全可满足进一步试验的要求。
212　LD 2PCR产物的回收和鉴定 图 1　金钗石斛花芽总 RNA的 1%变性琼脂糖凝胶电泳图F ig. 1　D ena tur ing agarose gel electrophoresis of tota l RNAfrom the flower bud of D endrobium nobile
图 2　LD 2PCR产物过柱分离回收电泳图
F ig. 2　The gel electrophoresis of LD 2PCR production throw CHROM ASP IN 400 in 111% agarose　　取 1μg总 RNA直接进行逆转录合成第 1链 cDNA; 取 1μL的第 1链产物通过 LD2PCR扩增富集第 2链 cDNA, 留取一半 dcDNA于 - 80℃保存备用。另一半 dcDNA的经 S fi I酶切、过柱回收较大片段的 cDNA, 电泳检测 , 结果如图 2所示 , 收集前 4管出现 cDNA的组分混合。将混合后的 LD2PCR产物的电泳检测结果如图 3所示 , 可知 LD2PCR产物的电泳结果呈现均匀的 smear涂布 , 大小在 011
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　4期 庄军平等 : 金钗石斛花芽 cDNA表达文库的构建及鉴定 　
～215 kb范围内 , 主要集中于 500 bp以上 , 且具有两条特征性亮带。这表明所合成的 cDNA编码蛋
白分子量较分散 , 金钗石斛花芽的成分多样和转录的 mRNA较为复杂 , 其中某两类成分的可能含量
相对较高。
213　金钗石斛花芽 cD NA表达文库的鉴定
据统 计 , 蓝 白 斑 测 得 的 重组 率 分 别 为
9912% ; 平板的单菌落数分别为 92、825和 2 619
个。据此推算 7μL双链 cDNA可获得的 cDNA表
达文库滴度为 :〔( 92 + 825 + 2 619) ×( 100 /41) 〕
×5 ×7 = 3102 ×105。从理论上计算 , 当 cDNA文
库达到 416 ×104 ～6 ×105 时 , 得到目的克隆的概
论为 99% , 本研究构建的文库容量为 3102 ×105 ,
已经能够满足克隆极低丰度 cDNA克隆的需要。
随机挑取 50个克隆 , 使用 T7和 SP6引物 ,
通过 PCR扩增鉴定阳性克隆和估计插入 cDNA片
段的大小。部分 PCR扩增的电泳结果如图 4所
示 , 显示大部分的插入片段在 500 bp 以上 ,
cDNA分布在 015～215 kb之间。
从该文库构建过程中所测定的总 RNA提取质
量、mRNA的分离效果、第 1链和第 2链 cDNA
的合成效果、双链 cDNA以及在文库重组克隆数、
重组率和插入片段大小等指标综合评估 , 该文库
的构建是成功的 , 质量符合优良文库的标准〔5〕,
完全可满足进一步试验的要求。
金钗石斛花芽 cDNA 表达文库的成功构建 ,
对于克隆与花芽分化相关基因 , 进而从分子水平
上为研究金钗石斛花芽分化机理奠定了基础。
图 3　dscD NA 112%琼脂糖电泳图
右侧为 DNA Marker, 左侧为 dscDNA, 两箭头所指为特异条带。
F ig. 3　112 % agarose gel electrophoresis of the synthesized dscDNA
M: DNA Marker; dscDNA: Double strand cDNA.
图 4　部分插入片段的 PCR检测
F ig. 4　PCR ana lysis of partia l cD NA in sert fragm en ts
参考文献 :
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