全 文 ：园 艺 学 报 2006, 33 (4) : 891～894
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 11 - 15; 修回日期 : 2006 - 04 - 27
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30170061) ; 广东省重大科技专项资助项目 (2003A2010401) ; 福建省青年科技人才创新
项目资金 (2004J052)3 通讯作者 Author for corrspondence
蝴蝶兰未受精胚珠离体培养的研究
伍成厚 1, 2, 33 潘一山 1 罗开梅 1 叶秀粦 23 梁承邺 2
(1 漳州师范学院生物系 , 福建漳州 363000; 2 中国科学院华南植物园 , 广东广州 510650; 3 广州市园林科学研究所 ,
广东广州 510405 )
摘 要 : 以蝴蝶兰大孢子母细胞时期的胚珠为外植体进行了离体培养的研究。结果表明 , 在 VW + BA
012 mg·L - 1 +NAA 012 mg·L - 1 +蔗糖 210% +植物凝胶 013%中蝴蝶兰的大孢子母细胞可以发育至二核胚
囊 ; 在 VW +BA 012 mg·L - 1 +NAA 012 mg·L - 1 +蔗糖 210% +植物凝胶 013% +椰子汁 10%中大孢子母
细胞可以发育至四核胚囊或形成胚性细胞团 , 这些胚性细胞团有可能发育成单倍体植株。
关键词 : 蝴蝶兰 ; 胚珠 ; 胚性细胞团 ; 组织培养
中图分类号 : S 682131 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0420891204
In V itro Culture of Unfertilized O vules in Pha laenopsis
W u Chenghou1, 2, 33 , Pan Yishan1 , Luo Kaimei1 , Ye Xiulin23 , and L iang Chengye2
(1D epartm ent of B iology, Zhangzhou N orm al College, Zhangzhou, Fu jian 363000, China; 2 Sou th China B otanica l Garden, the
Chinese A cadem y of Sciences, Guangzhou, Guangdong 510650, China; 3 Guangzhou Institu te of L andscape and Garden, Guang2
zhou, Guangdong 510405, Ch ina)
Abstract: The effects of medium composition on the in vitro culture of unfertilized ovules of a Phalae2
nopsis hybrid were studied. The results showed that the megasporocytes of the hybrid were capable of undergo2
ing meiosis to form bi2nucleate embryo sacs in vitro by ovule cultures on the medium of VW + BA 012 mg·
L - 1 + NAA 012 mg·L - 1 + sucrose 210% + phytagel 013%. On the medium of VW + BA 012 mg·L - 1 +
NAA 012 mg·L - 1 + sucrose 210% + phytagel 013% + coconut m ilk 10% , the megasporocytes would de2
velop into 42nucleate embryo sacs or embryogenic cell masses. These embryogenic cell massesmay develop in2
to hap loid p lants.
Key words: Pha laenopsis; Ovule; Embryogenic cell masses; Tissue culture
1 目的、材料与方法
未受精子房或胚珠离体培养 , 不仅是继花药培养之后单倍体育种的又一条可行途径〔1, 2〕, 而且开
辟了植物组织培养与被子植物胚胎学研究的新领域 ———在离体条件下对大孢子、雌配子体的发育及其
胚胎发生进行研究与控制〔1〕。
兰科蝴蝶兰属 ( Phalaenopsis) 植物经过长期杂交育种培育出许多具有观赏价值的品种 , 其组织培
养的研究主要是种子培养〔3〕和花梗的快速繁殖〔4, 5〕, 未受精胚珠离体培养的研究尚未见报道〔6, 7〕。作
者以蝴蝶兰杂交种 ( Phalaenopsis hybrid) 为材料 , 进行了未受精胚珠离体培养的研究 , 描述了蝴蝶
兰大孢子母细胞的离体发育过程〔7〕。本文报道培养基成分对试验结果的影响 , 为进一步建立蝴蝶兰
单倍体育种体系提供参考。
试材为中国科学院华南植物园温室栽培的蝴蝶兰杂交种 ( Phalaenopsis hybrid)。在 2000年 12
月～ 2003年 3月开花期间进行人工授粉 , 采集授粉 44 d发育正常的子房 (此时胚珠已经分化内、外
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园 艺 学 报 33卷
珠被 , 胚囊处于大孢子母细胞时期 )〔8〕, 常规消毒后 , 在超净工作台内取中部带有少量子房壁的胚珠
作为外植体。基本培养基为 MS、N6、B5、VW 培养基。蔗糖浓度 2% ～6% , 植物凝胶 013% , 单独
或组合加入 0～210 mg·L - 1的 NAA、BA, 椰子汁 0～10% , 水解酪蛋白 0～400 mg·L - 1 , 蛋白胨
0～2 000 mg·L - 1 , pH 510～610。暗培养 , 温度 (26 ±015) ℃。材料采用石蜡切片法制片、观察。
2 结果分析与讨论
211 基本培养基对蝴蝶兰未受精胚珠发育的影响
在 MS和 N6培养基上 , 子房壁的细胞大量增生、突起 , 不利于蝴蝶兰未受精胚珠的发育。胚珠离
体培养 4 d即由乳白色转变为浅黄色至黄褐色。珠被细胞的细胞质很快消失 , 细胞核中的染色质凝集
并随后溶解 , 只剩下细胞壁。由于珠被细胞很快解体 , 大孢子母细胞不能继续发育。在 B5、VW这两
种培养基上 , 体细胞组织增生较少 , 胚珠褐化速度较慢 , 较长时间呈乳白色 , 珠被细胞解体较迟 , 胚
囊能进一步发育。在 B5培养基上 , 培养 4 d胚珠的大孢子母细胞能发育至二分体 , 但随后也解体退
化。在 VW培养基上 , 胚珠的大孢子母细胞能经二分体 (图版 , 1、2) 发育至二核胚囊 (图版 , 3)。
212 BA、NAA对蝴蝶兰未受精胚珠发育的影响
植物生长调节剂对蝴蝶兰未受精胚珠离体发
育是非常必需的 (表 1)。在培养基未添加植物生
长调节剂时 , 蝴蝶兰胚珠离体培养 4 d, 约
9710%的胚珠解体 , 培养 13 d胚珠全部解体。培
养基单独添加 011～012 mg·L - 1的 NAA或 BA均
能降低珠被细胞解体的程度。但 NAA和 BA浓度
较高时不利于胚珠的发育。当 NAA浓度达到 110
mg·L - 1时 , 子房壁产生大量白色、松散的愈伤
组织 , 胚珠解体退化。BA的浓度增高到 110 mg
·L - 1时 , 胚珠也迅速褐化 , 胚囊很快解体。
单独添加 NAA或 BA , 大孢子母细胞只能启
动减数第 1次分裂形成二分体 ; 只有同时添加
NAA 012 mg·L - 1和 BA 012 mg·L - 1时才能继续
进行减数第 2次分裂 , 形成二核胚囊。
213 蔗糖浓度和 pH值对蝴蝶兰未受精胚珠发育
的影响
蔗糖浓度较低 ( 2% ) , 珠被细胞解体较迟 ,
胚囊能进一步发育 ; 蔗糖浓度为 4%和 6%时 , 珠
被细胞解体速度逐渐加快。由于珠被细胞解体后
胚囊难以继续发育 , 因此在进行蝴蝶兰未受精胚
珠的离体培养中 , 蔗糖浓度以 2%为宜。
培养基 pH值为 513或 516时 , 珠被细胞解体
较慢 , 胚囊能发育至二核或四核胚囊 (图版 , 4、5) ;
表 1 离体培养 13 d植物生长调节剂对蝴蝶兰胚珠发育的影响
Table 1 Effect of com b ina tion s of plan t growth regula tors
on d ifferen tia tion in v itro developm en t of Pha laenopsis
ovules cultured for 13 days
BA
(mg·
L - 1 )
NAA
(mg·
L - 1 )
胚珠数量 Number of ovules
观察总数
Total
ovules
大孢子母细胞
Megaspore
mother cell
二分体
Dyad
二核胚囊
B i2nucleate
embryo sac
解体的胚珠
D isrup ted
ovules
0 0 100 0 0 0 100
011 100 17 2 0 81
012 100 25 0 0 75
110 100 29 2 0 69
210 100 0 0 0 100
011 0 100 14 1 0 85
011 100 13 0 0 87
012 100 5 0 0 95
110 100 14 1 0 85
210 100 0 0 0 100
012 0 100 12 1 0 87
011 100 26 3 0 71
012 100 23 3 2 72
110 100 10 0 0 90
210 100 0 0 0 100
110 0 100 10 0 0 90
011 100 6 1 0 93
012 100 5 1 0 94
110 100 26 2 0 72
210 100 0 0 0 100
当 pH < 513或 pH > 610时 , 珠被细胞均加快解体 , 胚囊仅能发育至二分体随即退化。
214 有机添加物对蝴蝶兰未受精胚珠发育的影响
培养基中添加水解酪蛋白 400 mg·L - 1或蛋白胨 2 000 mg·L - 1对蝴蝶兰未受精胚珠的发育没有
促进作用 , 胚囊发育至二分体时期即退化。在添加 10%椰子汁后 , 约 30%的胚珠能发育至二核胚囊
(图版 , 3) 或四核胚囊 (图版 , 5) , 但与体内胚囊不同的是这些胚囊不能正常液泡化 , 在胚囊中部
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4期 伍成厚等 : 蝴蝶兰未受精胚珠离体培养的研究
没有形成中央大液泡 , 而形成的子核游离于胚囊内 , 不是位于胚囊的两端。
添加 10%椰子汁时 , 约有 5%的胚囊发育途径发生了改变。在二分体后期珠孔端的 1个二分体细
胞不退化 (图版 , 6) 而合点端的另一个细胞就进行第 2次分裂 (图版 , 7) , 从而在 1个胚囊内形成
3个细胞 (图版 , 8) , 这些细胞多次分裂 , 最终在 1个胚囊内形成了细胞团 (图版 , 9 ) , 这些细胞
具有较大的细胞核和很浓的细胞质 , 呈现胚性细胞的特征。这些胚性细胞团有可能进一步诱导单倍体
植株 , 从而为兰科植物的育种开辟一条新的途径。
图版说明 : 珠孔端向下 1. 二分体 , ×550; 2. 二分体 , 珠孔端的 1个细胞已经退化 (↑) , 合点端的细胞体积增大 , 成为功能大孢
子 , ×550; 3. 二核胚囊 , ×550; 4. 二核胚囊正在进行分裂 ( ↑) , ×550; 5. 四核胚囊 , ×550; 6. 两个细胞相等的二分体 , ×
550; 7. 示二分体珠孔端的细胞不退化 (∧) , 合点端的另一个二分体细胞正在分裂 (↑) , ×550; 8. 示 1个胚囊内形成的 3个细胞
(↑, ∧) , ×550; 9. 示胚囊内形成的胚性细胞团 , ×550。
Explana tion of pla tes: The m icropylar ends downward 1. Dyad, ×550; 2. Dyad, showing the cell (↑) at m icropylar end has comp ressed
and the chalazal one continues to enlarge, ×550; 3. B inucleate embryo sac, ×550; 4. B inucleate embryo sac in dividing (↑) , ×550; 5. 42
nucleate embryo sac, ×550; 6. Dyad, showing the two cells as the same size, ×550; 7. Dyad, showing the chalazal cell (↑) is dividing and
the m icropylar one (∧) does not degenerate, ×550; 8. Three cells (↑, ∧) formed in an embryo sac, ×550; 9. Embryogenic cell masses
formed in an embryo sac, ×550.
参考文献 :
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ny, 2004, 12 (2) : 129～132 ( in Chinese)
收稿日期 : 2005 - 10 - 19; 修回日期 : 2006 - 03 - 213 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wyshi@ zju1edu1cn)
基质栽培仙客来矿质营养吸收规律的研究
汤少红 1 石伟勇 13 余琼芳 2 张荣盛 2 (1 浙江大学环境与资源学院 , 环境修复与生态健康教育部重
点实验室 , 浙江杭州 310029; 2 浙江森禾种业股份有限公司 , 浙江杭州 310020)
Stud ies on M acronure ien t Absorption in C yclam en Cultiva ted in So illessM e2
d ium
Tang Shaohong1 , ShiW eiyong13 , Yu Q iongfang2 , and Zhang Rongsheng2 (1 College of Environm enta l and Resource
Sciences, M inistry of Education Key L ab of Environm ental Rem ediation and Ecosystem Health, Zhejiang U niversity, Hangzhou,
Zhejiang 310029, Ch ina; 2 Zhejiang Senhe Seed Co. , L td. , Hangzhou, Zhejiang 310020, Ch ina)
关键词 : 仙客来 ; 干物质 ; 矿质营养 ; 吸收
中图分类号 : S 68212 + 62 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0420894201
近几年 , 仙客来 (Cyclam en persicum ) 设施栽培产业在我国迅速发展 , 但由于引进的国外品种在我国栽培条件下
缺乏相应的技术研究 , 导致仙客来生产优质品率低、生产成本高。因此 , 探讨设施栽培条件下仙客来的营养吸收规
律 , 对制定优质仙客来生产的施肥技术具有指导意义。
本试验以日本的 NP系列 F1 代 NP3品种为试材。2002年 12月下旬播种于 288穴育苗盘 , 2003年 3月底移苗到 50
孔穴盘 , 2003年 5月上旬换盆定植于泥炭 : 珍珠岩 : 蛭石 = 5∶1∶1 (pH 610, EC 018 mS/cm, 速效 N 161188 mg/kg,
速效 P 29173 mg/kg, 速效 K 110 mg/kg) , 试验规模为 6 000盆 , 田间管理按浙江森禾种业公司技术体系最优化措施进
行。从 2003年 6月 25日开始采样到 2003年 12月 5日盛花期 , 每隔 30 d左右取 1次 , 每次 20株。仙客来用蒸馏水冲
洗干净 , 将根、球茎、叶分开 , 称其鲜样质量。在 105℃下杀青 30 m in, 60℃烘至恒重 , 称量。干样磨碎过筛后用 H2
SO4 - H2O2消煮 , 采用扩散法、钒钼黄比色法、火焰光度法、原子吸收分光光度法分别测定氮、磷、钾、钙、镁含
量。根据各生育期的干样质量和植株单位干样质量的矿质元素含量 , 计算出植株矿质元素的积累量和各生育期养分积
累率。
结果表明 , 在浙江杭州 , 仙客来在 10月份生长进入旺期 , 干物质积累量最大 ; 仙客来对矿质营养元素的吸收每
株平均 N为 0199 g, P为 0117 g, K为 0197 g, Ca为 0126 g, Mg为 0112 g。植株干物质量 ( x) 与矿质元素的积累量
( y) 的回归方程为 y = 010419 + 010608x, r = 0199383 3 。仙客来在越夏前 (5月上旬到 7月上旬 ) 生长逐渐加快 , 养
分吸收增加 , 但越夏期间 (7月中旬到 9月下旬 ) 生长缓慢 , 对矿质营养元素的吸收较少。越夏后 , 生长迅速 , 对矿
质营养元素的吸收积累出现高峰 , 其中 N、 P、Ca、Mg的吸收高峰出现在 10月份 , 养分积累率分别为 42185%、
39138%、55117%、66197% ; K的吸收高峰出现在 11月份 , 积累率为 44102%。仙客来植株体内 N、P、K、Ca、Mg
积累量的比值 , 越夏前为 59∶22∶60∶20∶10, 越夏后为 88∶22∶82∶17∶10; 盛花期为 82∶14∶81∶21∶10。因此 , 可根据仙
客来植株的干物质积累量来确定其各生育期矿质元素的需求量 , 从而确定仙客来各生育期需要肥料的比例和用量。
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