全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 1075～1078
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 12 - 20; 修回日期 : 2006 - 03 - 02
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30270924, 30471202)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: ganjuli_2002@mail1hzau1edu1cn)
柑橘钙调蛋白 cDNA的克隆及序列分析
岳海林 1, 2 　孟海军 1 　邓秀新 1 　彭抒昂 23
(1 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 湖北武汉 430070; 2 华中农业大学园艺林学学院 , 湖北武汉 430070)
摘 　要 : 以温州蜜柑 (C itrus unsh iu Marc. ) 幼果 cDNA第 1链为模板 , 参照大麦钙调蛋白基因序列
(Accession No. M27303) 合成 5pi端和 3pi端引物 , 以 PCR的方法扩增得到柑橘钙调蛋白 cDNA, 将其克隆到
PMD182T载体上并进行测序。序列分析表明 , 柑橘钙调蛋白 cDNA全长 453 bp, 共编码 148个氨基酸 , 与
大麦和大豆钙调蛋白基因的同源性均高达 83%以上 , 所编码氨基酸序列同源性达 97%以上。以该 cDNA作
探针进行点杂交 , 得到良好的杂交信号。
关键词 : 柑橘 ; 钙调蛋白 ; cDNA克隆 ; 序列分析
中图分类号 : S 666　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521075204
C lon ing and Sequence Ana lysis of C itrus Ca lm odulin cD NA
Yue Hailin1, 2 , Meng Haijun1 , Deng Xiuxin1 , and Peng Shupiang23
(1N ationa l Key L aboratory of C rop Genetic Im provem ent, Huazhong A gricu lture U nivercity, W uhan, Hubei 430070, China;
2 College of Forestry and Horticulture, Huazhong A gricu lture U niversity, W uhan, Hubei 430070, China)
Abstract: U sing the first strand cDNA from the immature fruits of C itrus unsh iu Marc. as temp late, we
amp lified and cloned the cDNA of C itrus calmodulin gene in this study. The PCR p rimers were designed ac2
cording to the sequences of barley calmodulin gene obtained from GenBank (Accession No. M27303). The
PCR p roductwas cloned into PMD182T vector and then sequenced. Sequence analysis indicated that the cDNA
of C itrus calmodulin gene contains 453 nucleotides coding for 148 am ino acid residues. The nucleotide se2
quences and their deduced am ino acid sequences of the C itrus calmodulin cDNA show an identity of above
83% and 97% , respectively, to those of barley and soybean. Southern dot blot analysis using the cloned cD2
NA as p robe confirmed the results of sequencing analysis.
Key words: C itrus; Calmodulin; cDNA cloning; Sequence analysis
1　目的、材料与方法
钙对果实品质的形成和保持有重要作用 , 且多是通过 Ca2 +与 CaM结合实现的〔1, 2〕。有研究表明 ,
果实发育大小〔3〕和果品贮藏性〔4〕与 CaM 的变化有关 , 认为 CaM 参与了果品贮藏及采后生理的变
化〔1, 5〕。钙调蛋白是一种小分子量、耐热的酸性蛋白质 (等电点为 319～413) , 与钙离子结合后作为
第二信使可调节生物体的一系列生理活动〔6〕。钙调蛋白基因的分离克隆对于阐明钙调蛋白的作用机
制及从分子水平上阐明植物生长发育的生理机制有十分重要的意义。目前 , 人们已从大麦〔7〕、大
豆〔8〕等多种植物上克隆得到钙调蛋白基因。本研究中克隆了柑橘的钙调蛋白 cDNA全长 , 为以后从分
子水平上研究钙与钙调蛋白在柑橘果实生长发育中的作用奠定基础。
温州蜜柑 (C itrus unshiu Marc. ) ‘国庆 4号 ’幼果采自华中农业大学国家柑橘育种中心标本实验
园 , 液氮速冻后 - 70℃冰箱保存备用。用异硫氰酸胍法提取幼果 RNA, 按 cDNA合成试剂盒 (MB I) 的
方法合成 cDNA第一链 , 并以此为模板 , 进行特异性扩增。引物参考大麦钙调蛋白基因序列设计 , 分别
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为 5pi端引物 GGCATGGCGGATCCGCTCACCGACGA和 3pi端引物 TCCCTAGGCCATCATGACCTTGAC, 由上
海生工生物工程有限公司合成。扩增程序为 : 94℃变性 4 m in, 94℃变性 60 s, 56℃退火 30 s, 72℃延伸
60 s, 共 32个循环。72℃保温 4 m in。PCR扩增产物经 118%的琼脂糖凝胶电泳后回收 , 连接到 PMD182T
载体 , 回收和连接均按照试剂盒说明操作。TA克隆试剂盒购自 Takaka公司 , DNA凝胶回收试剂盒购自
Omega公司。将质粒载体转化到 E. coli DH5α中。挑取白色菌落 , 碱裂解法小量提取质粒 DNA, 酶切检
测。由上海博亚生物有限公司对克隆的目的片段经过 M13 +向测序 , 分别在 Internet的 GenBank中用
B last软件和 EB I中用 ClustalW软件进行碱基序列和氨基酸序列的同源性分析。
参照程运江等〔9〕的方法提取 ‘金柑 ’、‘华农本地早 ’、‘国庆 4号 ’的 DNA, 进行 Southern dot
blot分析。
2　结果分析与讨论
211　钙调蛋白基因的体外扩增、克隆与筛选
用提取的总 RNA合成 cDNA第 1链 , 经 PCR
扩增得到约 450 bp大小的单一条带。回收扩增产
物后与载体热击转化到 E. coli DH5α中 , 挑取阳
性克隆 , 提取质粒 DNA, 用 B am HⅠ酶切得到与
插入外源片段大小相同的片段 (图 1) , 与国内外
报道的相吻合 , 初步说明克隆成功。
212　钙调蛋白 cD NA的全长序列分析
克隆片段的测序结果表明 , 本研究所得 cDNA
片段全长 453个碱基 , 共编码 148个氨基酸 (图
2, 3)。经软件分析发现 , 该片段与其它植物中
已克隆的钙调蛋白 cDNA相比有较高的同源性 , 如
图 1　质粒 PCR和酶切电泳图
1. 酶切质粒 ; 2. PCR产物 ; M. Marker。
F ig. 1　Agarose gel electrophoresis of PCR product
and d igested pla sm id D NA
1. D igested p lasm id DNA; 2. PCR p roduct; M. Marker.
与大麦、大豆等钙调蛋白相比 , 在碱基序列上同源性分别为 83%和 88% , 在氨基酸序列上的同源性
均为 99% , 相差仅 3个氨基酸。柑橘钙调蛋白与大麦在 11位由丝氨酸换为丙氨酸 , 在 88位由甘氨酸
换为谷氨酸 , 在 93位换为亮氨酸 , 而与大豆在 4位由脯氨酸换为谷酰氨 , 在 8位由天冬氨酸换为谷
氨酸 , 在 88位由甘氨酸换为谷氨酸。
图 2　柑橘与其它植物钙调蛋白基因序列同源性比较
1. 柑橘 ; 2. 大麦 ; 3. 大豆。
F ig. 2　Com par ison of nucleotide sequence of ca lm odulin gene from C itrus w ith tha t of other plan ts
1. Citrus; 2. Barley; 3. Soybean.
6701
　5期 岳海林等 : 柑橘钙调蛋白 cDNA的克隆及序列分析 　
图 3　柑橘钙调蛋白氨基酸序列同源性比较3 表示完全相同 ; ·表示完全不同 ; : 表示氨基酸不同 , 但性质相同。
1. 柑橘 ; 2. 大麦 ; 3. 大豆。
F ig. 3　Com par ison of deduced am ino ac id sequence of ca lm odulin of C itrus w ith tha t of other plan ts3 stands for comp letely the same; ·stands for comp letely different; : stands for that
the am ino acids are different, but their characters are same.
1. Citrus; 2. Barley; 3. Soybean.
钙调蛋白是一种高度保守的 Ca2 +结合蛋白 , 其碱基序列和氨基酸序列在不同物种间均有很高的
同源性〔10〕。本研究从柑橘中扩增的 cDNA与其它植物在碱基序列和氨基酸序列上分别可达 83%以上
和 99%的同源性 , 说明该 cDNA确为柑橘的钙调
蛋白 cDNA。
213　点杂交结果
以金柑 ( Fortunelle crassifolia Swingle)、华农
本地早 ( C itrus reticu la ta B lanco ‘Huanong Ben2
dizao’) 和国庆 4号 ( C itrus unsh iu Marc. ‘Guo2
qing 4’) 的 DNA点膜进行 Southern杂交 , 结果均
得到很强的杂交信号 (图 4)。说明在其它柑橘属
植物中存在同源拷贝 , 可以在柑橘植物上进行相
关分子生物学的研究。
图 4　点杂交结果
1. 金柑 ; 2. 华农本地早 ; 3. 国庆 4号。
F ig. 4　The result of southern dot blot
1. Kumquat; 2. Huanong Bengdizao; 3. Guoqing 4.
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收稿日期 : 2006 - 06 - 27; 修回日期 : 2006 - 08 - 11
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30670207)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: guanky@mail1kib1ac1cn)
土壤条件对 3种滇产马先蒿成苗的影响
李爱荣 　管开云 3 　 (中国科学院昆明植物研究所 , 云南昆明 650204)
Effects of So il Properties on Seedling Establishm en t of Three Pedicu la ris
Spec ies from Y unnan Prov ince
L i A irong and Guan Kaiyun3 ( Kunm ing Institu te of B otany, Chinese Academ y of Sciences, Kunm ing, Yunnan 650204, China)
关键词 : 引种栽培 ; 有效养分含量 ; 生态适应
中图分类号 : S 68　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521078201
野生马先蒿属 ( Pedicu laris L. ) 植物花冠奇特且形态变异复杂多样 , 颇具开发价值。本试验研究土壤条件对马先
蒿成苗的影响 , 为其引种驯化奠定基础。大王马先蒿大王变种、二歧马先蒿和浅黄马先蒿浅黄亚种种子均于 2004年 8
～9月分别采自澄江梁王山、中甸纳帕海和中甸五凤山。栽培试验在迪庆州中甸县格桑花卉公司栽培基地进行。格桑
基地和纳帕海的土壤整体肥力较高 , 梁王山的次之 , 五凤山的最低 (表 1)。分别以五凤山和格桑基地自然土 (对照 )
和灭菌 (121℃持续 2 h) 土为栽培基质 , 每处理 50粒种子 , 3次重复。2004年 12月播种 , 之后自然生长。
表 1　不同地点的土壤肥力状况测定结果
Table 1　Fertility testing results of so il sam ples from d ifferen t sites
地点
Site
全氮
TN ( % )
全磷
TP ( % )
全钾
TK ( % )
有机质
OM ( % )
水解氮
AN (mg/kg)
有效磷
AP (mg/kg)
有效钾
AK (mg/kg)
pH
梁王山 L iangwangshan 01795 01242 01404 22179 612131 1177 447181 5129
五凤山 W ufengshan 01158 01088 11472 3169 146116 1151 162107 5124
格桑基地 Gesang J idi 01469 01097 11555 9108 398111 2118 56179 8101
纳帕海 Napahai 01426 01117 11414 7183 352132 4156 199133 8105
结果表明 , 3种马先蒿于次年 7月底 ～8月初陆续出苗 , 成苗率低 (均 < 50% ) 且生长慢 (表 2)。与五凤山土壤
相比 , 格桑基地土壤中成苗率较高且幼苗长势较好 ; 除浅黄马先蒿浅黄亚种在五凤山土壤灭菌处理后成苗率和幼苗长
势明显降低外 , 其余两种在两类土壤灭菌处理中成苗率均
较未灭菌的高 , 但长势与未灭菌组差异不明显。分析认为
高压蒸汽灭菌在一定程度上增加了可溶性养分含量 , 尤其
是可溶性磷 , 故成苗状况优。浅黄马先蒿是五凤山的分布
种 , 在长期适应过程中对土壤中某些微生物形成了较强的
依赖关系 , 灭菌的同时也杀死了有益微生物 , 反而不利于
马先蒿生长。较肥土壤的灭菌组比原自然土中的成苗表现
良好 , 说明这些微生物并非马先蒿出苗和成苗所必需 , 土
壤肥力及其它理化性状才是影响成苗的关键因素。
表 2　3种马先蒿在不同土壤处理中的成苗率
Table 2　Seedling establishm en t performance of three Pedicu la ris
spec ies in d ifferen t so il trea tm en ts ( % )
土壤处理
Soil treatment
大王马先蒿
大王变种
P. rex var. rex
二歧马先蒿
P. dichotom a
浅黄马先蒿
浅黄亚种
P. lu tescens
subsp. lu tescens
格桑灭菌土 GS 34100 a 43133 a 28100 a
格桑自然土 GN 23133 b 18100 b 6100 c
五凤山灭菌土 W S 32100 a 14100 b 0167 d
五凤山自然土 WN 18167 b 9133 c 18167 b
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