全 文 ：园 艺 学 报 2007，34(6)：1431—1436
Acta Horticuhurae Sinica
番茄果实采后 NAD激酶活性与活性氧代谢的关系
朱冬雪 ，顾采琴 ，陶 华 ，黄仁莲
( 广州大学生命科学学院，广州 510006； 广州大学化学化工学院食品系，广州 510006)
摘 要：以番茄 (Lycopersicon esculentum Mil1．)粉红期果实为试材，研究了采后果实在 4℃和 20℃下
贮藏期间成熟衰老过程中NAD激酶 (nicotinamide asenine dinucleotide kinase，NADK)活性及其底物 NAD
(H)、产物 NADP(H)以及超氧阴离子 O： 生成速率 、过氧化氢 (H O )、丙二醛 (MDA)含量的变化 ，
并分析了其相互关系。结果表明，番茄果实在 4~C贮藏时 ，NADK受到激活 ，贮藏前期活性 比后期高；在
20~C贮藏时，NADK除了在贮藏后期出现一个高峰外 ，整个贮藏期活性比4~C的低 ；NAD(H)含量的变化趋
势与 NADK活性的变化趋势相反。4~C贮藏的 NADP(H)含量高于 20℃下贮藏的，贮藏前期高于贮藏后期；
同时，在 4℃贮藏期间果实 O 生成速率、H O 含量、膜氧化产物 MDA含量以及番茄红素含量均比20℃贮
藏的低 ，说明低温在延缓果实衰老的同时激活了NADK活性，NADK可能通过影响 NAD(H)、NADP(H)的
含量及比例来调控O 生成速率和H O 含量，从而调控番茄果实的成熟衰老。
关键词：番茄；成熟衰老；NAD激酶；NAD (H)；NADP(H)；活性氧
中图分类号：S 641．2 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2007)06—1431-06
Relationship Between NAD Kinase and Active Oxygen During Ripening and
Senescence of Postharvested Tomato Fruit
ZHU Dong—xue‘
，
GU Cai—qinh
， TAO Hua ，and HUANG Ren—lian
( College of Science，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China； Department of Food Science，Guangzhou
University，Guangzhou 510006，China )
Abstract：Tomato(Lycopersicon esculentum Mil1．)periearp at pink stage was used to investigate the
changes of NAD kinase(NADK)activity and reactive oxygen during ripening and senescence of postharvest
tomato fruit at4℃ and 20~C．Contents ofNAD(H)，NADP(H)and hydrogen peroxide(H2O2)and superox—
ide production rate(O2：)were determined．The degree of the oxidative damage to the membrane lipids(MDA
content)and ripening index(1yeopene content)were also examined．The results showed that NADK activity
increased sharply at early stage and declined significantly at late stage during ripening and senescence at 4~C，
but its activity kept lower at 20~C except higher activity was observed on the 5th day of storage at 20~C．The
change model of NAD(H)content contrasted with one of NADK activity．Higher NADP(H)content was
found at early store stage than at late store stage and at 4℃ than at 20℃ ．Significant increase of lyeopene con—
tent was observed at late store stage at 20~C ，but little change was found at the same stage at 4℃ ．O2 produc—
tion rate and H，O， content at all store stage at 20℃ were significantly higher than those at 4℃ ．The maxi—
mum MDA content appeared earlier at 20℃ than at 4℃ ．NADK mi【ght be involved in postponing ripening and
senescence 0f D0stharvest tomato fruit by regulating the content and proportion of NAD(H)to NADP(H)
which influenced the O， production rate and H，O，content．
Key words：Tomato；Ripening and senescence；NAD kinase；NAD(H)；NADP(H)；Active oxygen
收稿日期：2007—06—19；修回日期：2007—09—29
基金项目：国家自然科学基金项目 (30360069)
通讯作者 Author for correspondence(E—mail：gcq86@1 63．com)
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园 艺 学 报 34卷
NAD激酶 (NADK)是目前所发现的生物体内惟一催化 NAD磷酸化生成 NADP的酶 (McGuin—
ness&Butler，1985)。生物体内的NAD和 NADP至少参与300多个不同的氧化还原反应。NADH和
NADPH在电子传递过程中均会产生 O i和 H O ，促进膜的氧化 (孙大业 等，1999；Schopfer et a1．，
2001)，从而加速植物衰老。大量研究表明，活性氧代谢失调是导致果实衰老的重要原因 (王爱国，
1998；关军锋 等，2002)。番茄是典型的呼吸跃变型果实，据报道，番茄果实采后活性氧代谢失调是
导致果实成熟衰老的重要原因 (张少颖 等，2005)，其成熟衰老过程与 NADK有关 (顾采琴 等，
2002)，但 NADK是否与活性氧代谢有关尚未见报道。作者研究了跃变型果实番茄采后成熟衰老过程
中NADK活性变化及其与NAD(H)、NADP(H)含量及活性氧代谢和膜氧化产物变化的关系，以探
讨 NADK在跃变型果实成熟衰老过程中的作用，为进一步调控果实的成熟衰老提供理论依据。
l 材料与方法
2005年4月从花溪大道温室大棚采回粉红期番茄 (Lycopersicon esculentum Mil1．)，品种为 ‘红
粉’。经挑选后，每3 kg果实置于一筐，共装 6筐。各取 3筐分别放入 20℃和4℃的贮藏室进行贮
藏，相对湿度约90％。每天随机取 5果，去心后捣碎，混匀，称量，然后用液氮速冻，放入 一80℃
冰箱中保存备用。试验数据采用 Excel软件进行统计分析。
NADK的提取参照顾采琴等 (2002)的方法，生成物 NADP的测定参照 Gibon和 Larher(1997)
的方法进行。所有测定至少重复3次。
蛋白含量测定参照 Bradford(1976)的方法，以BAS为标准蛋白。重复 3次。
NADP、NADPH、NAD和 NADH的测定均参照 Gibon和Larher(1997)的方法并作适当修改：取样
液 10 L，加入 200 L混合液 (1 mol·L～tricine—NaOH、40 mmol·L～EDTA、4．2 mmol·L～MTY、
16．6 mmol·L～PES、25 mmol·L～G-6一P或5．0 mol·L 乙醇)，再加入 150 txL 0．1 mol·L～NaC1，于
37~C恒温水浴中保温5 min，取出后放入冰浴中加入 50 txL 6一磷酸葡萄糖脱氢酶或乙醇脱氢酶，再于
37~C恒温水浴中培养40 min，取出加入200 txL 6 mol·L NaC1溶液终止反应，接着 12 600 r·min 常
温离心 15 min，弃上清液，用 1．5 mL 95％乙醇溶解，待完全溶解后于570 am处测定 OD值。
H O 、超氧阴离子 (O )和丙二醛的测定参照吕成群和黄宝灵 (2004)的方法进行。
番茄红素和叶绿素的测定参照刘愚等 (1990)的方法进行。
2 结果与分析
2．1 番茄红素和叶绿素的变化
由图 1可以看出，番茄果实采后置于20~C下，番茄红素逐渐增加，叶绿素快速下降后趋于平稳，
而4~C下二者变化缓慢。由此判断低温延缓了果实采后的成熟衰老程度。
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图1 粉红期番茄果实采后番茄红素和叶绿素含量的变化
Fig．1 The changes of lyeope ne and chlorophyll contents in postharvested tomato fruit during ripening and senescence
0 9 8 7 6 5 4 3 2 0
c；0 0 0 c；0 0 0
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6期 朱冬雪等：番茄果实采后 NAD激酶活性与活性氧代谢的关系 1433
2．2 NADK活性的变化
由图2可见，番茄果实采后于低温 (4℃)下贮藏时，NADK活性受到激活，贮藏 1 d后上升达
到峰值，随后降低，然后一直保持在较低水平。20~C贮藏的番茄 NADK活性在贮藏 1 d后却迅速降
低，维持 3 d后到第 4天时开始上升，在第5天达到高峰，随后降低。整体上看，低温贮藏的番茄果
实 NADK活性比常温贮藏的高，二者差异达显著水平 (P<0．05)，说明低温可以激活 NADK活性。
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贮藏天数 Days of storage(d)
图2 番茄果实采后成熟衰老过程中NADK活性和NAD含量的变化
Fig． 2 Changes of NADK activity and NAD content in postharvest tomato fruit
during ripening and senescence
2．3 NAD含量的变化
NAD是 NADK作用的底物，在 NADK催化下发生磷酸化生成 NADP。由图2可见，低温 (4℃)
下贮藏的番茄 NAD含量在前 5天呈波浪式上升趋势，贮藏2 d后出现一个小峰，第 5天达到最高值，
随后下降。20~C下贮藏的变化趋势和低温贮藏的相似，但贮藏2 d后就达到高峰值，随后保持较低水
平。可见，两种温度下贮藏的番茄果实 NAD含量的变化与酶活性变化一致。
2．4 NADP含量的变化
NADP是 NAD磷酸化的产物。NADK活性高，必然导致 NADP含量亦高。由图3可见，两种温度
下 NADP含量变化趋势相似，低温 (4℃)贮藏的番茄 NADP含量比20~C下贮藏的高，二者差异达显
著水平 (P<0．05)。
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贮藏天数 Days of storage(d)
图3 番茄果实采后成熟衰老过程中 NADP和 NADH含量的变化
Fig．3 Changes of contents of NADP and NADH in postharvest tomato fruit
during ripening and senescence
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2．5 NADH含量的变化
NADH是 NAD从电子传递体上获得电子后的还原态形式，在电子传递过程中又继续将电子传给
电子受体。由图3可见，低温下贮藏的番茄果实 NADH含量一直呈上升趋势，到 11 d时，约为采收
当天的4倍。常温下贮藏的番茄果实 NADH含量于贮藏 2 d时就达到高峰，随后逐渐降低。总体上
看，常温下贮藏的番茄 NADH含量高于低温下的，与 NAD (图2)含量的变化趋势一致。
2．6 NADPH含量的变化
NADPH也是NADP从电子传递体上获得电子后的还原态形式，继续将电子传给电子受体。番茄
果实采后成熟衰老过程中 NADPH含量变化趋势和 NADP含量变化趋势类似 (图4)，低温下贮藏3 d
时达到高峰，随后呈波浪式变化，而20~C下的含量明显比低温下的低，二者差异达极显著水平 (P<
0．01)。总之，NADPH、NADP以及 NADK三者的变化趋势具有较好的吻合性。
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贮藏天数 Days of storage(d)
2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 l1 12
贮藏天数 Days of storage(d)
图 4 番茄果买采后成熟衰老过程中 NADPH含量和 o2’生成透翠的变化
Fig·4 Changes of NADPH content and 02 production rate in postharvest tomato fruit
during ripening and senescence
2．7 超氧阴离子生成速率的变化
0 ：和H 0 均属活性氧，被认为是植物代谓}过程中的毒副产品，能引起植物体内大分子物质如脂
类、蛋白质及 DNA的损伤。由图4可知，番茄果实采后于 20~C下贮藏，其超氧阴离子 (0 )的生
成速率在前期呈上升趋势，贮藏4 d时达到高峰，随后急剧下降，贮藏 8 d时下降到最低点；低温下
与常温下相似，呈波浪式变化，到12 d时才达到高峰，峰值不到常温下的1／2，说明低温可以明显抑
制番茄果实 0 的生成速率。
2．8 H：O：含量的变化
采后于20~C下贮藏的番茄果实，H 0 含量在贮藏 2 d时达到高峰，随后下降，呈波浪式变化；
而在低温下贮藏的果实则呈波浪式上升趋势，贮藏1 1 d时含量最高 (图5)。20％下番茄的H 0 含量
明显高于低温，二者差异达显著水平 (P<0．05)。可见，0 和 H 0 均对番茄果实的成熟衰老起着
重要的作用。
2．9 MDA含量的变化
由图5可知，贮藏于20％下的番茄果实，贮藏 1 d后膜氧化产物 MDA含量达到了高峰，明显高
于低温下贮藏的，随后下降，一直保持略高于低温下的。低温下的果实 MDA含量变化较平缓，于贮
藏 7 d时才达到高峰，随后含量也开始下降。可见，番茄果实膜氧化产物的积累与活性氧含量的变化
呈正相关关系。
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6期 朱冬雪等：番茄果实采后 NAD激酶活性与活性氧代谢的关系 1435
量
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
贮藏天数 Days ofstorage(d) 贮藏天数 Days ofstorage(d)
图5 番茄果实采后成熟衰老过程中过氧化氢 (H2o2)和丙二醛 (]MDA)含量的变化
Fig．5 Changes of contents of H2O2 and MDA in postharvest tomato fruit
during ripening and senesCenCe
3 讨论
番茄红素含量常被用于判断番茄果实的成熟度。采后的绿熟番茄果实贮藏于低温下，番茄红素含
量明显低于 20~C贮藏的果实，但是果实的 NADK活性在低温下却受到激活 (图 1)，比20~C贮藏的活
性高，与绿豆下胚轴放在低温下 NADK受到激活类似 (Juan et a1．，2000)，说明低温在延缓果实后熟
衰老的同时激活了 NADK活性，这是低温延缓番茄采后成熟衰老的原因之一。
NADK催化 NAD与 ATP生成 NADP(McGuinnes&Butler，1985)。NAD与 NADP是细胞溶质中
起关键作用的氧化剂，它们含量的改变不仅引起细胞氧化还原状态的改变，而且引起细胞信号转导途
径的改变 (Graham，2006)。NAD主要参与糖酵解 (EMP)和三羧酸循环 (TCA)，NADP则主要参
与磷酸戊糖途径 (PPP)(Zerez et a1．，1987)。有研究表明，NAD能促进三羧酸循环中苹果酸的氧化
(Shugaev，2001)。
图2和图3显示，低温贮藏番茄的 NAD含量比20~C贮藏的低，NADP含量则 比20℃贮藏的高，
由此可推测低温可能诱导了番茄的PPP途径提高，而20~C下的呼吸则可能以EMP和TCA途径为主。
低温下PPP途径得以活化而高温能提高 EMP比率在甜樱桃休眠芽上也有类似的报道 (李霞 等，
2004)。由于 EMP和 TCA是呼吸作用的主干线，PPP是支路，所以，低温下番茄呼吸若以 PPP途径
为主，其呼吸速率必定比常温下以EMP和 TCA为主要途径的低 (顾采琴 等，2002)，呼吸消耗少，
相应贮藏寿命得以延长。可见，NADK活性改变可通过改变番茄的NAD与 NADP比例而可能改变其
呼吸途径，从而改变呼吸代谢速率及果实的成熟衰老进程。
植物处于氧化胁迫时，NADPH在平衡植物细胞氧化还原方面起很重要的作用 (Requel et a1．，
2006)。NADH、NADPH在电子传递过程中，均会产生 O 和 H O ，促进膜的氧化 (孙大业 等，
1999；Schopfer et a1．，2001)，但 NADH比NADPH传递电子的速率快 (孙大业 等，1999)。
有研究观察到，当NADPH含量下降时，可导致细胞的抗氧化机理遭到破坏，引起细胞逐渐死亡
或凋亡 (Klaidman et a1．，2001)。图 3和图4结果显示，20℃下番茄的 NADH含量比低温下高，而
NADPH却比低温下的低，这可能会导致 20~C下番茄电子传递的速率比低温下快，抗氧化能力降低，
产生的活性氧也比低温下的多。图4和图5的结果显示，番茄采后 20~C下活性氧 0 的产生速率和
H 0 含量均比低温下高，进一步证明了这一结论。以上结果表明，当NADH和NADPH的比例发生变
化时，细胞的氧化速率也随之改变。20~C下是否可以通过提高NADK活性以利于延缓果实的成熟衰
老，有待于进一步研究。
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