全 文 ：园 艺 学 报 2007，34(6)：1531—1534
Acta Horticulturae Sinica
梨矮化基因pcDw的一个 SCAR标记
贾彦利，王彩虹 ，田义轲，戴洪义，王 亮
(青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109)
摘 要：以 ‘矮化梨’(Pyrus communis L．)与 ‘茌梨’(Pyrus bretschneideri Rehd．)的杂交后代共 111
个单株为试材 ，采用分离群体分组分析法 (bulked segregate analysis，BSA)，通过对412个随机引物的筛选 ，
获得了一个与控制梨树矮化性状基因pcDw连锁距离为 8．3 cM、长度为 940 bp的 RAPD标记 S．n ，并将
其转换成了 SCAR(sequence characterized amplified region)标记，即 SCAR． 。这一研究结果 ，为该矮化性
状的标记辅助选择提供了有效工具。
关键词：梨；矮化；RAPD；SCAR
中图分类号：S 661．2 文献标识码：A 文章编号：0513．353X (2007)06．1531-04
A SCAR M arker Linked to pcDw Gene in Pear
JIA Yan—li，WANG Cai—hong ，TIAN Yi—ke，DAI Hong—yi，and WANG Liang
(Colege ofHorticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China)
Abstract：To identify molecular markers linked to pcDw gene determining the dwarf character of pear
tree，a population of lll individuals from the cross of‘Aihuali’ (Pyr communis L．)X‘Chili’ (Pyr
bretschneideri Rehd．)was tested using 412 random primers by the way of bulked segregate analysis(BSA)．
A RAPD marker，S1172
- 94o ， linked to pc gene at a distance of 8．3 cM ，was detected．This RAPD marker
was converted into a SCAR(sequence characterized amplified region)marker，SCAR ，which would pro—
vide an efective tool for marker assisted selection for the dwarf trait．
Key words：Pear；Dwarf；RAPD；SCAR
矮化是与果树栽培模式密切相关的重要农艺性状，果树矮化栽培模式的发展，迫切需要优良的矮
化砧木和矮化品种。因此，对矮化性状的研究具有重要的现实意义。以往已见一些关于苹果矮化性状
遗传规律和分子标记的研究，但对梨的矮化性状研究很少，也未见有关其分子标记的报道。1991年，
作者从英国东茂林试验站 (East Mailing Research)引入西洋梨矮化型实生变异品种 ‘Le Nain Vert’
的种子，播种后获得具有母本矮化性状的实生后代，将其定名为 ‘矮化梨’。意大利的 Rivalta等
(2002)已研究表明该矮化性状受控于一个显性基因 (pcDw)。本研究以 ‘矮化梨 ’与 ‘茌梨’杂交
后代群体为试材，通过分离群体分组分析 (BSA)方法，用 RAPD技术筛选与该矮化基因相关的标
记，在此基础上，开发简单稳定的SCAR标记，为该性状的辅助选择提供简便快速的工具。
1 材料与方法
1．1 材料
试材取自青岛农业大学果树实验站。矮化梨 (矮型)、茌梨 (正常型)及其杂交后代群体 111
株。
收稿日期：2007一o4—09；修回日期 ：2007—09—07
基金项目：山东省自然科学基金项 目 (Y2003DO1)；青岛市科技攻关项 目 (05-2·NS一18)；山东省良种产业化项目
$通讯作者 Author for correspondence(E·mail：chwang@qau．edu．ca)
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园 艺 学 报 34卷
1．2 基因组 DNA提取
采用改良的CTAB法提取基因组DNA (Tian et a1．，2004)。用琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA质量，
并估算其浓度，将最终浓度调至25 ng／ L左右。
1．3 近等基因池构建
根据BSA法的原理，将杂交后代个体按高矮性状分为矮型组和高型 (即正常型)组。从两组中
分别抽取10个单株，将其DNA样品等量混合，组成矮型基因池和高型基因池。
1．4 RAPD及产物鉴定
RAPD在 PTC-200基因扩增仪上进行。反应体系和扩增程序参考 Tian等 (2004)的方法。扩增
产物经 1．2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为 1×TAE，电压为4—5 V／cm，于 UVP成像系统中
观察照相，记录观察结果。
1．5 梨矮化性状标记的筛选
先用大量的随机引物在两个对比基因池上进行 RAPD扩增，筛选出在基因池间具有多态性的引
物，然后再用这些多态性引物在杂交后代的分离群体上作进一步验证分析，以确定所获得的多态性片
段是否为与梨矮化性状相关的分子标记。统计群体上的共分离分析结果，计算标记与目标性状间的重
组率，并根据Kosambi函数估算遗传连锁距离 (莫惠栋，1996)。
1．6 RAPD标记片段的回收、克隆与测序
用玻璃珠 (Silver Beads)DNA回收试剂盒 (购 自上海 Sangon公司)从琼脂糖凝胶上回收标记
DNA片段。将其连接到 pGEM．T easy vector载体，用热激法将其转化到大肠杆菌细胞，扩大繁殖。用
碱法提取质粒，通过酶切鉴定确定克隆片段的正确性。将含克隆质粒的菌液送至上海 Sangon公司测
序。
1．7 SCAR标记的转换
根据RAPD标记片段的测序结果，设计特异引物。引物合成由上海 Sangon公司完成。SCAR—
PCR反应产物在 1．2％琼脂糖凝胶上电泳检测。
2 结果与分析
2．1 矮化性状 RAPD标记的筛选
通过对412个引物在两对比基因池间的筛选以及群体上的验证分析，最后发现来自引物s 的扩
增片段 (约900 bp)为与矮化性状相关的标记片段 (图 1)。在 111株杂交后代的55株矮型个体中，
有4株表现重组；56株高型个体中有5株表现重组。即标记与矮化性状的重组率为8．1％。用 Kosam—
bi函数计算表明该标记与矮化基因pcDw的遗传距离为8．3 cM。
— — 2000 bp
— — 1 000 bp
_ — — — — 750 bp
_ _ _ _ _ — — 500 bp
图1 引物 8172在两基因池及Fl部分个体上的扩增结果
1．矮型基因池；2．高型基因池；3～14．矮型个体；15~23．高型个体；M．DNA marker DL2000；箭头所指为标记片段。
Fig． 1 The amplification result ofprimer Sire in the two bulks and several FI progenies
1．Bulk of dwarf type：2．Bulk of normal type；3一l4． rhe progenies with dwarf character；15-23．The progenies with normal character；
M．DNA marker DL 2000；The specifc fragment WfS indicated by the 8ITOW．
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6期 贾彦利等：梨矮化基因pcDw的一个SCAR标记 1533
2．2 RAPD标记片段克隆的酶切鉴定
回收 PCR产物时，由于易受一些非特异性带的干扰，克隆的很可能不是 目标带。因此对所获得
的克隆片段必须检测，以确定其正确性。在含Amp的蓝／白斑选择平板上，共挑取5个白色克隆菌斑
和 1个蓝色菌斑 (对照)，扩大繁殖后提取质粒，用 EcoR I酶切鉴定。结果发现，来 自5个白色菌斑
的质粒均切出了约 600 bp和300 bp的两条带 (图2)，两者之和与原 RAPD片段大小相近。
2 3 4 6 M
图2 重组质粒的EcoRI酶切检测
l～5．重组质粒；6．空白质粒 (对照)；M．DNA marker DL 2000。
Fig．2 Recombinantplasmids digested byEcoR I
l一5．Recombinant plasmids；6．Con~ol；M．DNA marker DL 2000．
。 _ _ _ _ — — 2 000 bp
— — 1 000 bp
。 。 。 。 。 — — 750 bp
· _ _ _ _ _ — — 500 bp
_ _ _ _ _ _ — — 250 bp
— — 100 bp
2．3 RAPD标记序列及 SCAR标记转换
2．3．1 BAPD标记测序结果 从 1—5号克隆中抽取2个进行测序。结果表明，两个克隆的测序结果
完全相同，片段序列如下：
GT TTACCCCTTCCCATCTTCTAGCATCCATCCTGCTGTGCTGT1．AACAGTCACACTCCGTCTCATCTTCCAGTCA
CCACCTTTCTCAACTTCAGTTpLTCTTTGTGCATGCTTTACAGCTTATTTGTTTGAAGTTGTTGTGAACA A=IlAA A=rTTT
TAGCATGTAGTCTTCAAACTTAATGAAAGTTGTTTAATCA TACGGTTAGTGTA GTGATTA TGATTTTGTTCC
TGTTGTTA ACTGAGTA ATA A A-TTTTGGTCAAGTGATATGTGTTGAATTTTCTTTTTArGCTCTGTAGGTTGAAGACAC
TGCAAATTTTCAAGGACATGAGGCTGGTGA1AGCCAATCGAG I℃ATATAGAGGA TTCAGAAGGTGCTCTTAGCT
TAGCGTTCGACAGATTCTTCTTGTGTTATCATTTCACCTTCA TCTTTTTGGAATTTGCATCTAGTTTATTGAAATGT
GGGAGGTTATTGCTTTTGCAGGATGAAGTGGTGACCGA T^ATCCGTCGGAGGCTGTTTCAGCTCAACAAGAAGAA
GTTCAGCTAGAAACAGAAGCAGACTACAACCAGAGAGArGTAGAA=n℃GAGCAACAGCATGCTTCTCGCAGACCA
TpLTCAAAACCAAAGAGGCGGTCGTGGGGGGGAGGTGGCCGCAGAGGTTACACTAATGGCCGTGGAGGCCGAGGC
AA=rGGCAGAGGAGGTGGTTCCTTCCAGAArGGTCGTAACCAGT—LTTACGACCAGCCTGGAAArI TpLTCCAAGAC
CCCAC1lArAAC A ATAGGGGTAGGGGCGGG1．AGGGGTGGCGCGGC 蛆℃T1．ACAACCACCAAGGTGCAGC I℃AAGAG
GGTCATGCCTCGGCCAACGTTGGAGTTGCT1℃G CGGTACATTCAGTCTCTGCAGAATGCT I℃TT I℃TAGTTTT
TGTATGGGGCGGTGGGGGTAAGAC
分析发现，该片段内部确实含有一个 E_c0R I酶切位点 (双下划线部分)，可以将该片段分成 583
bp和357 bp两个片段，这与质粒的酶切检测结果相吻合。单下划线部分为 S。 引物结合位点。
2．3．2 SCAR引物的设计与PCR扩增 根据序列特点用 DNAMAN软件设计一对用于 SCAR—PCR的
特异引物。上游引物序列为：5 ．GTC r丌A CCC cTr CCC ATC TFC一3 ；下游引物序列为：5 一AC CGC
CCC ATA CAA AAA CT一3。序列中的粗体部分为 SCAR引物结合位点。通过优化分析，确定 SCAR—
PCR的最佳反应体系为：在25 总体系中含有模板 DNA 25 ng，Mg¨ 2．25 mmol／L，Taq酶1．0 U，
反应程序中的退火温度为62℃，25个循环。
用该对特异引物在两亲本、两对比基因池及总群体上进行分析，扩增结果表明该RAPD标记已被
成功转换为SCAR标记 (图3)，即 SCAR枷 。SCAR枷在分离群体中与 目标性状的分离重组行为与原
RAPD标记的表现完全一致。
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1534 园 艺 学 报 34卷
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 l0 ll l2 l3 l4 15 16 17 l8 19 20 21 22 23
图3 SCAR~4o特异引物在亲本、基因池及部分 Fl杂交后代个体上的扩增产物电泳图谱
M．DNA marker DL 2000；1．矮化梨；2．矮型基因池；3．茌梨；4．高型基因池；5～13．矮型后代个体；14～23．高型后代个体。
Fig．3 The amplification result of SCAR~4o specific primers in parents。bulks and several Fl progenies
M． DNA marker DL2000；1． ‘Aihuali’；2．Bulk of dwarftype；3． ‘Chili’；4．Bulk of normal type；
5—13．Dwarf progenies；14—23．Normal progenies．
3 讨论
目前生产上应用的果树矮化砧木和矮化品种的矮化性状多数遗传机制比较复杂，通过常规育种技
术很难将其用于树体的遗传改良。然而，在果树中也发现了部分由质量性状控制的矮化性状，这些基
因资源对果树树型改造有特殊意义。近年来，已有一些关于矮化基因标记的研究报道。如 Tian等
(2005)已用 RAPD、SSR及 SCAR标记对苹果的 c0基因进行了标记及区域作图。毕晓颖等 (2002)
曾获得了1个与苹果显性矮化主基因 Dw连锁距离为0．69 cM的 RAPD标记。
将 RAPD标记转换为 SCAR标记，可以很好地解决其稳定性的问题。因此，这一方案已在众多性
状的分子标记研究中得到实施，如桃的有毛／无毛 (姜立杰 等，2005)、葡萄的无核性状 (杨英军
等，2002)。本研究将pcDw基因的RAPD标记Sl172 成功转换为SCAR标记，在矮型个体上扩增出一
条目标带，而高型个体中目标带表现缺失，这非常便于眭状的区分。此研究结果无疑对梨树该矮化性
状的标记辅助选择 (MAS)和pcDw基因的区域作图具有重要的意义。但 MAS要求的分子标记与目
标基因的连锁距离一般应在 5 cM以内，因此，还应该继续开发与 pcDw基因连锁更为紧密的分子标
记。
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