全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 827 - 832
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 01 - 25; 修回日期 : 2008 - 05 - 123 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jjlei@ scau1edu1cn)
菜薹花芽分化及 B rcuFLC基因的克隆与表达
肖旭峰 , 曹必好 , 王　勇 , 陈国菊 , 雷建军 3
(华南农业大学园艺学院 , 广州 510642)
摘 　要 : 通过制作石蜡切片研究了菜薹 [B rassica cam pestris L. ssp. chinensis (L. ) Makino var. utilis Ts2
en et Lee ] 早熟品种 ‘油青四九 ’和晚熟品种 ‘油青甜菜心 80天 ’的花芽分化过程 , 结果表明 , 当展开 2
～3片真叶时花芽分化开始启动。用已报道的拟南芥 Flow ering locus C ( FLC) 基因和 FR IGIDA ( FR I) 基因
的保守区域设计引物 , 通过 RT2PCR的方法从两个菜薹品种中均克隆得到了两个决定开花的关键基因 , 并
命名为 B rcuFLC ( GenBank登录号为 EF138603) 和 B rcuFR I ( GenBank登录号为 EU700362)。半定量式 RT2
PCR表达分析表明 , B rcuFLC基因在早、晚熟菜薹品种的不同发育时期表达存在差异 , 表达量随真叶数增
加而逐步减少 , 但在晚熟品种中 B rcuFLC表达量降低幅度小 ; B rcuFR I则在早、晚熟品种的所有阶段表达都
较低。B rcuFLC在菜薹不同部位表达的情况不同 , 在茎、叶中的表达强 , 花次之 , 根中表达较弱 ; 而 B rcu2
FR I在早、晚熟品种根中的表达量明显高于其它 3个部位。
关键词 : 菜薹 ; Flow ering locus C基因 ; 表达
中图分类号 : S 63415　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620827206
Study on Flower Bud D ifferen tia tion and C lon ing and Expression of B rcuFLC
in B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis ( L. ) M ak ino var. u tilis
X IAO Xu2feng, CAO B i2hao, WANG Yong, CHEN Guo2ju, and LE I J ian2jun3
(College of Horticulture, South China A gricultura l U niversity, Guangzhou 510642, China)
Abstract: The morphogenesis of the flower buds of the early and late varieties of flowering Chinese cab2
bage was found to be almost the same. A ll flower buds began to differentiate at the 2 to 3 leaves stage. Based
on the conserved sequence of Flow ering locus C ( FLC) and FR IGIDA ( FR I) gene of A rabidopsis tha liana, a
612 bp fragment with an ORF encoding 198 am ino acids and a 463 bp cDNA fragment were amp lified by RT2
PCR from cDNA of flower stalk and were named B rcuFLC ( GenBank accession number: EF138603) and B r2
cuFR I ( GenBank accession number: EU700362). Sem i2quantitative RT2PCR analysis showed that the exp res2
sion of B rcuFLC was different in the early and late varieties. W ith the increase of the leaves, the B rcuFLC ex2
p ression of two varietieswere decreased, but the decrease quantity was not obvious in the late variety. The ex2
p ression of B rcuFR I was very low in both of two varieties. B rcuFLC would transcrip t differently at various
sites. The intensity of the stem and leave was more stronger than that of flower and root, but for the B rcuFR I
exp ression, the intensity of the root was the most strong in four organs.
Key words: flowering Chinese cabbage; B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis (L. ) Makino var. u tilis
Tsen et Lee; f low ering locus C gene; exp ression
在拟南芥中至少有 5条途径促进开花 : 光周期途径、自主开花途径、春化途径、GA途径和单独
的 FR I途径 (Levy & Dean, 1998; Henderson & Dean, 2004; M ichaels et al. , 2004) , 从拟南芥中分离
的春化作用关键基因 f low ering locus C ( FLC) 是揭示控制开花时间和春化反应分子机理的重要进展。
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
FLC属于 MADS盒基因 , 以一种类似变阻器的量的方式抑制植物开花 (M ichaels & Amasino, 1999;
Sheldon et al. , 1999)。低温处理对 FLC有负调控作用 , 低温处理时间越长 , FLC的表达则越弱 , 植
物将提早开花。FR I ( FR IGIDA ) 途径是一条单独控制植物开花的途径 , 也是另一个决定开花的主要
位点。它编码的蛋白可使 FLC的 mRNA转录水平升高 , 从而延迟开花。自主开花途径是对光周期或
春化信号都不敏感的开花途径。植物生长到一定阶段后 , 体内的另一组基因 : FCA、 FLD、 FPA、
FV E、FY和 LD相互拮抗、相互协同调节植物开花。当 FCA、FLD、FV E和 LD 正常表达时 , 它们共
同抑制下游关键调节基因 FLC表达而促进植物开花。自主开花途径可被显性的 FR I基因所减弱。FLC
这个共同的目标基因同时在春化途径和自主开花途径中影响着植物的开花时间。
菜薹 [B rassica cam pestris L. ssp. ch inensis (L. ) Makino var. u tilis Tsen et Lee ] 是南方特产蔬菜之
一。菜薹的形成是一种抽薹现象 , 与其它蔬菜的抽薹一样 , 都是从花芽分化发育过程的中途开始 , 由
分化了的花芽发育起来而从莲座叶丛抽出花薹的现象。菜薹发育对低温的要求不严格 , 在生产上即使
不经受低温诱导也能正常抽薹开花。这与白菜、萝卜、甘蓝等低温春化、未熟抽薹的机理不尽相同。
本试验首先制作石蜡切片确定菜薹的花芽分化的起点 ; 并通过 RT2PCR方法从菜薹的早、晚熟两个品
种 cDNA中分别克隆了 FLC和 FR I两个基因 , 利用半定量式 RT2PCR方法对菜薹 FLC基因表达特性进
行了初步探讨 , 以期为研究菜薹抽薹的分子机理提供理论依据。
1　材料与方法
111　材料
菜薹极早熟品种 ‘油青四九 ’和晚熟品种 ‘油青甜菜心 80天 ’购自广东省农业科学院蔬菜研究
所 , 于 2006年 3月 9日分别播种于营养钵 , 置于光照培养箱中。待苗期长出第 1片真叶开始至完全
抽薹开花期间 , 每隔 5 d随机采取其中 10株用于制作石蜡切片观察花芽发育 , 若干用液氮处理后
- 80 ℃冰箱保存 , 用于提取 RNA、cDNA第 1链的合成及 RT2PCR分析。
112　石蜡切片的制作
参照李正理 (1978) 的方法 : 纳瓦兴溶液固定 , 艾氏苏木精整体染色 , 梯度酒精脱水 , 五级氯仿
透明 , 石蜡包埋 , 二甲苯脱蜡 , 中性树胶封片 , 光学显微观察 , O lympus数码显微摄影。
113　总 RNA提取及 FLC、FR I基因的 cD NA克隆
根据石蜡切片的研究结果 , 确定菜薹花芽分化的始期后 , 分别提取 2个品种花芽分化前、后展开
第 1～5片真叶和完全抽薹开花 6个时期及第 6个时期的根、茎、花、叶总 RNA。具体提取方法参照
Invitrogen公司 Trizol试剂盒说明书。
RT2PCR方法按 Takara公司生产的 mRNA Selective PCR Kit Ver111试剂盒说明书进行。FLC基因
PCR扩增的上、下游特异引物序列为 : 5′2CGCTCTAGAATGGGAAGAAAAAAACTAGAA23′和 5′2ATA2
GAGCTCCTAATTAAGTAGTGGGAGAG23′, 是根据拟南芥 FLC蛋白的 mRNA编码序列 ( GenBank登录
号为 : AF537203) 设计的 (L i et al. , 2005) , 分别含有 X ba I和 Sac I两个限制性内切酶位点。FR I基
因则以 5′2GCAGTGGAAACATTCAAACGCCA23′和 5′2CAGGCATTAGAAGAAAAGACTCCAG23′为上、下
游特异引物 , 也是根据拟南芥 FR I基因的保守序列设计的。所有引物均由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。PCR反应条件为 94 ℃ 3 m in, 94 ℃ 1 m in, 54 ℃ 50 s, 72 ℃ 1 m in, 30个循环 , 最
后 72 ℃再延伸 10 m in。PCR产物经过 112%琼脂凝胶电泳检测 , 回收采用 Takara胶回收试剂盒。回
收产物与 PUCm 2T (上海生工 T载体试剂 ) 载体连接。连接产物转化受体大肠杆菌 DH5α感受态细
胞 , 由华南农业大学园艺生物技术所提供 , 蓝白斑筛选阳性克隆。碱裂解法小量提取质粒 DNA, FLC
及 FR I基因分别采用 X ba I、Sac I和 EcoR I、H ind Ⅲ双酶切鉴定后 , 将检测结果含阳性质粒菌的菌液
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　6期 肖旭峰等 : 菜薹花芽分化及 B rcuFLC基因的克隆与表达 　
送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
114　菜薹 FL C和 FR I基因的表达分析
分别提取菜薹早、晚熟品种第 6个时期的根、茎、花、叶 4个部位及花芽分化完成和完全抽薹开
花共 6个时期材料的总 RNA, 反转录成 cDNA为模板 , 利用半定量式 RT2PCR对 FLC及 FR I基因进行
时空特异性表达分析 , 以十字花科蔬菜β2actin基因的保守序列设计引物 , 获得 399 bp的基因片段作
为内标基因。β2actin基因上、下引物序列为 actin2up: 5′2GACTACGAGCANGAGNTNGAGAC23′和 actin2
dn: 5′2CTGTTGGAANGTGCTGAGGGA23′。
2　结果与分析
211　菜薹花芽形态发育
抽薹是花芽分化后生殖生长的一个过程 , 在其发育的中途便开始了。由于品种特性和植株个体间
生长发育的不同 , 因而不同品种花芽的形态发育进程是有差异的。根据石蜡切片显微观察 (图 1) ,
早熟品种 ‘油青四九 ’的花芽分化始期略早于晚熟品种。当 ‘油青四九 ’的幼苗展出两片大真叶时 ,
花原基即开始分化 (图 1, 3) , 当展出四片真叶一大心时 , 第 1个花原基的花器官分化完成 , 形成了
第 1个完整的花蕾体 (图 1, 6) ; 晚熟品种 ‘油青甜菜心 80天 ’则当展开两片大真叶一小心时 , 才
开始分化花原基 (图 1, 9) , 从营养生长转入生殖生长 , 待展出五片真叶一小心时 , 第 1个花蕾体发
育才完成 (图 1, 12) , 稍不同于早熟品种 ‘油青四九 ’。结果基本与关佩聪和梁承愈 ( 1985) 的报
道相符 , 表明不同菜薹品种 , 其花芽分化的始期也存在差异。
图 1　菜薹花原基形成
1～6. 早熟品种 ; 7～12. 晚熟品种 ; 1, 7. 一小真叶一心 ( ×10) ; 2, 8. 一大真叶一小真叶 ( ×10) ;
3, 9. 两大真叶一小心 ( ×10) ; 4, 10. 两大真叶一大心 ( ×10) ; 5, 11. 三真叶一心 ( ×10) ;
6. 四真叶一大心 ( ×10) ; 12. 五真叶一小心 ( ×10)。
gc. 生长锥 ; lp. 叶原基 ; fp. 花原基 ; se. 萼片 ; ca. 雌蕊 ; st. 雄蕊。
F ig. 1　The in itia l stage of flower pr im ord ium d ifferen tia tion in flower ing Ch inese cabbage
1 - 6. Early variety; 7 - 12. Late variety. 1, 7. The shoot apex has not been differentiated ( ×10) ;
2, 8. The flower p rimordium is going to differentiate ( ×10) ; 3, 9. The initial stage of
flower p rimordium differentiation ( ×10) ; 4, 10. Volume increasing of floral p rimordium ( ×10) ;
5, 11. Sepal formation ( ×10) ; 6, 12. Carpel and stamen formation ( ×10) .
gc. Growth cone; lp. Lobarp rimordium; fp. Floral p rimordium; se. Sepal; ca. Carpel; st. Stamen.
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212　菜薹 B rcuFL C和 B rcuFR I基因的克隆
总 RNA琼脂糖凝胶电泳结果 (图 2) 表明 , 28S rRNA、18S rRNA条带清晰且 28S rRNA条带的
亮度是 18S rRNA的两倍 , 表明 RNA质量较好 , 将其反转录成 cDNA并 RT2PCR扩增。
图 2　B rcuFLC和 B rcuFR I基因在菜薹不同发育时期的表达
E: 早熟品种 ; L: 晚熟品种 ; 1、2、3、4、5、6分别代表 1、2、3、4、5真叶期和完全抽薹开花时期。
F ig. 2　The RT2PCR expression results of B rcuFL C and B rcuFR I in six per iods of flower ing Ch inese cabbages
E: Early variety; L: Late variety. 1, 2, 3, 4, 5, 6 indicate the period of
first, second, third, fourth, fifth true leaves and the comp leted flowering period.
在早、晚熟两个品种中均获得了 600 bp和接近 500 bp左右的单一条带 , 符合预期大小 (图 3,
图 4)。
图 3　B rcuFLC基因 RT2PCR产物的电泳结果
M: DL2000; 1. 早熟品种 ; 2. 晚熟品种。
F ig. 3　Electrophoresis of RT2PCR product of B rcuFLC
M: DNA marker; 1. Early variety; 2. Late variety.
图 4　B rcuFR I基因 RT2PCR产物的电泳结果
M: DL2000; 1. 早熟品种 ; 2. 晚熟品种。
F ig. 4　Electrophoresis of RT2PCR product of B rcuFR I
M: DNA marker; 1. Early variety; 2. Late variety.
纯化的产物与 T载体连接后转化大肠杆菌 , 每个菜薹品种各挑取蓝、白斑提取质粒酶切 , 酶切
后的泳带与目的片段大小完全相同 (图 5, 图 6) , 表明目的片段已克隆到载体上。
图 5　B rcuFLC重组克隆鉴定
M: DL2000; 1. PCR产物 ; 2. PUCm2T空质粒 ;
3. 重组质粒 ; 4. 重组质粒双酶切产物。
F ig. 5　C lon ing of am plif ied fragm en t in to PUCm 2T of B rcuFLC
M: DL2000; 1. PCR p roduct; 2. PUCm2T;
3. The recombinant p lasm id; 4. Recombinant p lasm id
digested with Xba I and Sac I.
图 6　 B rcuFR I重组克隆鉴定
M: DL2000; 1. PCR产物 ; 2. PUCm2T空质粒 ;
3. 重组质粒 ; 4. 重组质粒双酶切产物。
F ig. 6　C lon ing of am plif ied fragm en t in to PUCm 2T of B rcuFR I
M: DL2000; 1. PCR p roduct; 2. PUCm2T;
3. The recombinant p lasm id; 4. Recombinant p lasm id
digested with EcoR I and H ind Ⅲ.
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　6期 肖旭峰等 : 菜薹花芽分化及 B rcuFLC基因的克隆与表达 　
　　此后 , 将鉴定为阳性的克隆进一步测序 , 结果表明 : 根据拟南芥 FLC保守序列设计的引物 , 在
菜薹的早、晚熟品种中扩增的基因片段大小为 612 bp , 与大白菜栽培品种 ‘Pekinensis’的 FLC
(DQ866876) 同源性达到了 99% , 与拟南芥的 FLC (AF537203) 也达到了 93% , 将该基因命名为
B rcuFLC , 提交 GenBank, 登录号为 EF138603。另一扩增目的片段测序后 , 大小为 463 bp , 与十字花
科蔬菜芥蓝 FR I (DQ503574) 同源性达到了 95% , 与拟南芥的 FR I (NM116290) 也达到了 80%以
上 , 将该基因命名为 B rcuFR I, 提交 GenBank, 登录号为 EU700362。
213　B rcuFL C和 B rcuFR I基因在菜薹不同发育时期特异性表达分析
从图 2可以看出 , B rcuFLC基因在两个不同熟性菜薹品种的不同发育时期中表达量存在差异 , 但
品种间区别不大。随着真叶数的增加 , 表达量均逐步减少 , 早熟品种中更为明显。当两者都完全抽薹
开花后 , 该基因的表达量明显降低 , 说明该基因的表达量与抽薹特性呈负相关。
B rcuFR I的表达在两个品种中都较弱。早熟品种随真叶数增加 , 其表达水平逐渐增加 , 但前期不
明显 , 营养生长后期和完全抽薹开花后表达量增加 ; 晚熟品种中其表达水平基本一致 , 表达均很弱。
214　B rcuFL C和 B rcuFR I基因器官特异性表达分析
分别将早、晚熟根、茎、花、叶 4个部位的总 RNA反转录 cDNA, 采用 RT2PCR半定量法对 B r2
cuFLC及 B rcuFR I基因进行器官特异性表达分析。结果 (图 7 ) 表明 , B rcuFLC基因在两个品种的 4
种器官中均有表达 , 器官间差异显著 , 且早、晚熟品种中也存在细微的差异。茎和叶 B rcuFLC基因表
达量明显强于花和根 , 根中几乎检测不到。而 B rcuFR I基因在根中的表达强于其它 3个部位 , 早、晚
熟品种的茎、花和叶中表达量基本一致。
图 7　B rcuFLC和 B rcuFR I基因在菜薹不同器官中的表达
E: 早熟品种 ; L: 晚熟品种 ; r、 s、 f、 l分别代表根、茎、花、叶器官。
F ig. 7　Expression of B rcuFLC and B rcuFR I in root, stem, flower and leaf of flower ing Ch inese cabbages
E: Early variety; L: Late variety; r, s, f, l indicate root, stem, flower and leaf.
3　讨论
普通白菜变种几乎所有品种都需经过低温春化后才能完成营养生长向生殖生长的转变。春化需求
型植物 , 在发育过程中通过低温处理抑制 FLC的转录及蛋白质的表达水平从而促进植物抽薹开花。
B. napus MADS基因 (AAK70217) 及拟南芥 FLC基因 (AAN04056) 均能延迟抽薹开花 , 是调节春
化型植物抽薹开花的一个关键基因 ( Sheldon et al. , 2000; Tadege et al. , 2001)。菜薹是白菜的一个变
种 , 却是典型的非低温春化型蔬菜 , 开花前不需要低温春化的诱导 , 对光周期也不敏感。因此与其他
十字花科蔬菜低温诱导促进抽薹的分子机制可能并不相同。我们根据已报道的 FLC基因序列设计引
物 , 从菜薹中分离出该基因 , 并对其表达特性进行初步研究。比较发现 B rcuFLC基因序列与 B. na2
pus MADS基因及拟南芥 FLC基因等氨基酸序列具有很高的同源性 , 其编码的蛋白质属于 MADS2box
蛋白。随真叶数目增多 , 熟性不同的菜薹品种即使前期不经低温诱导处理 , B rcuFLC基因的表达量仍
随植株个体的发育而逐渐降低 , 表明 B rcuFLC编码开花的抑制因子 , 其表达量与抽薹开花生殖生长呈
一定程度的负相关。本试验结果表明 , 菜薹抽薹开花途径可能不属于春化作用途径。
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拟南芥中有一个依赖 FR I的突变体类型 , 自主信号途径的作用能够被 FR I依赖途径所取代 , 但春
化作用却能抑制 FR I依赖途径 (M ichaels et al. , 2004)。对非春化型的植物来说 , 自主开花途径中的
任何一个基因的过表达均能抑制 FR I对开花的抑制作用 , FCA和 FR I对抗性作用影响着 FLC的mRNA
转录水平 (Quesada et al. , 2003)。本试验结果表明 , FR I在早、晚熟品种的所有发育时期中都有表
达 , 表达量有差异。有活性的 FR I基因在菜薹发育前期正向调控 FLC的转录水平 , 从而使 FLC基因
表达量高且稳定 ; 当抽薹开花后 , FR I表达量即使增加 , FLC转录水平也已经较低 (图 2 )。由此可
见 , 菜薹中 FLC基因表达很可能受到了其它某些基因的负调控 , 这组基因的正常表达同时也抑制了
FR I基因对开花的抑制作用。因此 , 从本试验的研究结果推测 , 菜薹可能主要是通过自主开花途径来
促进抽薹开花的 , 但要弄清其自主开花途径中调控抽薹开花机制 , 还需作进一步深入研究。
春化的低温感受部位是茎尖。M ichaels和 Amasino (2000) 利用 RNA2blot分析拟南芥中 FLC基因
的空间表达模式时 , 发现 FLC的表达主要在茎尖、根尖等春化作用接受部位。春化作用信号在停止
低温后 , 可通过许多细胞的有丝分裂来保持。本研究得出了 B rcuFLC的空间表达的结果与春化途径的
接受位点不太一致。B rcuFLC基因表达强度在根、茎、花和叶中存在很大差异 , 这可能是基因调控上
存在差异。茎和叶属于营养器官 , 大量抑制开花的基因表达物质积累于此 , 正向调控 B rcuFLC表达 ,
使它增强。菜薹开花后 , 作为开花强抑制因子的 FLC , mRNA转录水平受到其他基因的抑制而使表达
量自然减少 , 因此两个品种的花中 B rcuFLC基因的表达水平均很低。B rcuFLC基因在两个品种根部的
表达量都非常弱 , 但 B rcuFR I的表达却很强 , 这可能与菜薹是非春化植物或者与生物体由于某些基因
的相互拮抗和协同作用的调控抑制了该基因在根部的表达有关 , 但具体原因还需进一步研究。
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