全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (11) : 1607 - 1612
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 06 - 02; 修回日期 : 2008 - 09 - 11
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30571274, 30771474) ; 农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yongchen1du@mail1caas1net1cn)
番茄 CONSTANS类似基因的克隆与表达分析
叶雪凌 1 , 刘志勇 2 , 王孝宣 2 , 杜永臣 23 , 国艳梅 2
(1 首都师范大学生命科学学院 , 北京 100037; 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 以一个受生物钟调节的番茄转录衍生片段 ( transcrip tion2drived fragment, TDF) 为信息探针 ,
通过在 NCB I EST数据库中进行电子延伸和 RT2PCR验证 , 获得了番茄 CO类似基因的 cDNA全长序列 , 命
名为 S lCO1 ( GenBank登录号 , EU636698)。SlCO1蛋白含有 386个氨基酸 , 氨基端存在两个 B2box型锌指
结构 , 羧基端含有一个 TTC结构域。SlCO1蛋白与 CO类蛋白的氨基酸一致性为 34% ～46% , 但在 B2box锌
指和 CCT结构域处高度保守。基因组序列包含 1个 535 bp的内含子 , 位于 B2box锌指和 CCT结构域之间。
表达谱分析表明 , S lCO1在叶片中优势表达 , 在根和茎中表达较弱。S lCO1的克隆为了解 CO类似基因在番
茄开花中的作用奠定了基础。
关键词 : 番茄 ; 开花时间 ; CONSTANS 类似基因
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1121607206
M olecular C lon ing and Expression Ana lysis of a CON STANS 2like Gene
S l CO 1 from Solanum lycopers icum
YE Xue2ling1 , L IU Zhi2yong2 , WANG Xiao2xuan2 , DU Yong2chen23 , and GUO Yan2mei2
( 1 College of L ife Science, Capita l N orm al U niversity, B eijing 100037, China; 2 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cad2
em y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, China)
Abstract: Derived from tomato and influenced by circadian clock, a transcrip tion2drived fragment
( TDF) was used as a seed sequence for searching homologous ESTs through electronical elongation in NCB I
database. A full2length CON STAN S 2like gene designed as S lCO1 ( GenBank accession number, EU636698) ,
is cloned using RT2PCR. The deduced SlCO1 p rotein consisting of 386 am ino acid residues contains two B 2box
zinc finger motifs near the am ino term inus and a conserved CCT domain near the carboxy term inus. Moreover,
a 535 bp intron is located between the B2box and CCT domain. A lthough SlCO1 p roteins shares 34% - 46%
identity w ith other CO p roteins, the deduced am ino acid sequence is highly conserved in the B 2box and CCT
domain. S lCO 1 exp resses specifically and strongly in leaf, but weakly in root and stem. Cloning of S lCO 1
w ill p rovide a scientific basis for understanding the role of CON S TAN S 2like genes in tomato flowering
p rocess.
Key words: tomato; Solanum lycopersicum ; flowering time; CONS TANS 2like gene
植物开花诱导过程由遗传和外界环境因素共同决定。长日照植物拟南芥开花诱导受 4种反应
途径调控 : 光周期途径、自主途径、春化途径和 GA途径 (Mouradov et al. , 2002; Simp son & Dean,
2002)。
CON S TAN S基因 (CO ) 编码锌指蛋白 , 是拟南芥光周期调控开花途径的关键性组分 ( Putterill
et al. , 1995)。拟南芥植株内的 CO蛋白含量高于某一阈值 , 才会激活 FLOW ER IN G LOCUS T ( FT)
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和 SOC1等下游靶基因 , 促进植株开花 , FT蛋白可能就是研究者长期以来所寻找的 “开花素 ”
( Samach et al. , 2000; Corbesier et al. , 2007)。拟南芥 CO突变体表现为长日照开花延迟 , 一些异
源 CO基因 (如短日照植物牵牛花 PnCO基因和长日照植物萝卜 B nCO 基因 ) 转入拟南芥 CO 突变
体中 , 可以使 CO突变体恢复到正常表型 , 显示了植物 CO类似基因在开花时间控制途径上的保守
性和重要性 (Robert et al. , 1998; L iu et al, 2001)。CO类似蛋白均含有两类保守结构域 : N端的
B 2box型锌指结构域和靠近 C端的 CCT结构域 ( CO , CO 2L ike, TOC1蛋白 )。B 2box型锌指结构可
能介导蛋白质间的互作 , 而 CCT结构域广泛存在于生物钟调节基因中 , 参与蛋白质互作与核定位
( Strayer et al. , 2000; Robson et al. , 2001; Laubinger et al. , 2006)。CO类似基因以基因家族形式存
在 , 拟南芥含有 17个 CO类似基因 , 水稻则有 16个。目前 , 研究者已经克隆了 3个番茄 CO 类似
基因的基因组序列 ( TCO 1、 TCO 2和 TCO 3) , 但以上基因可能与植物开花无关 (Ben2Naim et al. ,
2006)。
本研究中以表达受生物钟调节的番茄转录衍生片段 ( transcrip tion2drived fragment, TDF) 的 TDF1
(NCB I登录号 , EX487877) 为信息探针 , 采用电子克隆策略结合 RT2PCR验证 , 克隆了 1个新的番茄
CO类似基因———S lCO1, 分析了其编码序列和表达模式 , 为进一步研究 CO类似基因在番茄开花中的
作用奠定了基础。
1　材料与方法
111　材料
试材为番茄品系 Saladette (美国番茄遗传中心 , 编号 LA2662) , 由中国农业科学院蔬菜花卉研究
所鲜食番茄课题组提供。种子催芽后播种于育苗盘 , 幼苗长至一叶一心时移入育苗钵中 , 以草炭、蛭
石、鸡粪 (6∶3∶1) 为培养介质 , 培养于日光温室 , 温度保持在 15～30 ℃之间 , 其余为常规管理。
当幼苗长至三叶一心时 , 转入人工气候箱 ( PRX2450, 中国赛福 )。
组织表达分析取样 : 昼 /夜温度为 25 ℃ /20 ℃, 光照强度为 500μmol·m - 2 ·s- 1 , 光周期 14 h /
10 h, 湿度保持在 75% ～85% , 适应生长 3 d。第 4天给予光照 12 h后 , 取根、茎 (第 2、3片真叶
之间部分 ) 和第 3片真叶 , 液氮速冻后保存于 - 80 ℃备用。
光周期处理 : 设置 8 h /16 h和 16 h /8 h两种光 /暗周期处理 (其他培养条件同组织表达分析 ) ,
先在各光周期处理条件下生长 3 d, 然后于光照后 1、4、7、10、13、16、19和 22 h, 取第 3片真叶 ,
液氮速冻后保存于 - 80 ℃备用。
112　D NA、RNA的分离与 cD NA第一链的合成
叶片 DNA提取参照 W illiam son等 (1994) 的 CTAB小量提取方法。总 RNA的提取采用 Trizol试
剂 ( Invitrogen) 按照说明书进行。用无 RNase的 DNase I (天根公司 ) 除去 RNA中的痕量 DNA。按
SuperScrip tⅢ反转录试剂盒说明书 ( Invitrogen) , 取 2μg总 RNA合成第一链 cDNA , 用作 RT2PCR模
板。
113　番茄 CON STAN S类似基因 cD NA和基因组序列的克隆
以 TDF1为信息探针 , 搜索 NCB I番茄 EST数据库 , 将检出的重叠 EST序列拼接为重叠群
( contig) , 再以此重叠群序列重复以上 B last搜索过程 , 直至重叠群不再继续延伸 (黄骥 等 ,
2002) , 利用 DNAStar推测开放阅读框。根据延伸序列 , 设计特异性引物 Co2L: 5′2AAGAT2
GGGCATATTTAGAGAAG23′和 Co2R: 5′2TTTAGTTACCAAAATACCCTTCC23′, 在不同器官的混合
cDNA和叶片 DNA中扩增目的基因。
PCR程序 : 94 ℃ 3 m in; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 m in, 30个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in。
PCR产物经琼脂糖凝胶回收后克隆至 pGEM 2T easy载体 ( Promega) , 转化 TOP10感受态细胞 , 筛
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选阳性克隆后送交北京三博远志公司测序。
利用 NCB I的 B lastP和 B lastN程序搜索同源基因。
114　生物信息学分析
cDNA序列的 ORF查找及翻译采用 DNAStar软件 ; 功能域预测采用 SMART ( http: / / smart1embl2
heidelberg1de / ) 程序进行 ; 利用 ClustalX1181软件对不同植物来源的 CO蛋白序列进行比对 , GenDoc
软件输出比对结果 , 比对序列包括拟南芥 ( CO , X94937 )、番茄 ( TCO1, AY490251; TCO3,
AY490253)、牵牛花 ( PnCO , AF300700) 和萝卜 (R sCOL1, AF052690)。
115　番茄 S lCO 1表达分析
用于 S lCO1表达分析的引物 : CO21, 5′2AGAAGAAGATGGGCATATTTAGAG23′和 CO22, 5′2CCGTT2
GATTGATACGAGGAG23′。PCR反应程序 : 94 ℃ 3 m in; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 30个循
环 ; 72 ℃延伸 5 m in。
延伸因子基因 EF12α为内部参照 , PCR引物 : EF12α2L, 5′2CCACCAATCTTGTACACATCC23′和
EF12α2R, 5′2AGACCACCAAGTACTACTGCAC23′。PCR扩增程序 : 94 ℃ 3 m in; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30
s, 72 ℃ 60 s, 24个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in。
PCR扩增产物经 210%琼脂糖凝胶电泳分离 , B io2RAD凝胶成像系统显示结果。
2　结果与分析
211　番茄 CON STAN S类似基因 S lCO 1全长 cD NA和 D NA序列的克隆
利用 cDNA2AFLP分析番茄高温胁迫下基因差异表达时 , 在对照处理内筛选得到 1个表达受生物
钟调节的 TDF。以此 TDF为信息探针 , 在 NCB I番茄 EST数据库中进行电子延伸 , 最终得到 1 353 bp
的拼接序列 , 受 19个信息探针的完全支持。经 DNAStar软件初步分析 , 该延伸序列具有完整的 ORF,
编码 386个氨基酸。
以电子延伸序列为模板 , 设计特异引物进行 RT2PCR, 得到 1 304 bp的验证序列 , 与电子延伸序
列仅存在极少数 SNP (图 1)。经 ORF搜索与 B last分析 , 确定该基因起始密码子在第 4位 , 终止密码
子在第 1 163位 , 与植物 CO类基因同源性较高。
因此推定得到了番茄 CO 类似基因的全长 cDNA 序列 , 命名为 S lCO1, GenBank 登录号为
EU636698。相应基因组序列长 1 839 bp, 包含一个 535 bp的内含子 , 位于 CCT和 B2box结构域之间 ,
剪切位点符合 “GT2AG”法则 (图 1, 图 2)。
图 1　S lCO 1 RT2PCR验证与基因组扩增
M: DNA标准分子量 ; 1: 基因组扩增产物 ; 2: RT2PCR产物。
F ig. 1　 Iden tif ica tion of the RT2PCR and PCR product by agrose gel electrophoresis
M. DNA molecular mass marker; 1. PCR p roduct of the genome;
2. RT2PCR p roduct.
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图 2　番茄 CON STAN S类似基因 S lCO 1的 cD NA序列及推导的氨基酸序列
阴影部分为 B2box锌指结构 ; 下划线为 CCT结构域 ; 3 代表内含子在基因组序列中的位置。
F ig. 2　The nucleotide ac id sequence and deduced am ino ac id sequence for S lCO 1, a toma to CONSTANS 2like gene
Shaded frame indicates the B2box zinc finger domains; CCT motif is underlined; Intron locus is indicated by asterisk.
212　SlCO1蛋白保守结构域与同源性分析
SlCO1蛋白含有 386个氨基酸 , 相对分子质量为 4216 kD , 等电点 p I = 6164。经 SMART程序在线
预测 , SlCO1蛋白无跨膜结构与信号肽 , 为水溶性蛋白 , 氨基端含有两个 B 2box型锌指结构域 , 羧基
端含有 43个氨基酸的 CCT结构域 (图 3)。两个 B 2box锌指构型为 CX2 CX8 CX7 CX2 CX4 HX(2或 8) H (X
为任意氨基酸 , 见图 3) , 与拟南芥 CO蛋白构型相似 ( Putterill et al. , 1995)。基于氨基酸序列的同
源性分析表明 , SlCO1蛋白同 TCO1和 TCO3的一致性为 4514%和 4211% , 与其他植物来源 CO类似
蛋白的一致性同样较低 , 如与 CO、R sCOL1 和 PnCO 的氨基酸一致性分别只有 34%、 4416%和
3615% , 但在 B2box锌指结构和 CCT结构域处高度保守 , 推断 S lCO1是具有生物功能的 CO 类似基
因。值得注意的是 , CO类似蛋白的中部区域保守性很低 , 但仍有少数氨基酸序列表现为高度保守 ,
如 1、2、3、4处 (图 3)。在羧基末端 , 含有 6个氨基酸的保守序列 ( G2V / I2V2P2S2F /Y) , 显示
S lCO1属于 CO类似基因的第一组群。
213　S lCO 1基因表达分析
基于 RT2PCR的表达分析表明 , S lCO1在叶片中优势表达 , 在根和茎中表达较弱 (图 4, A )。两
种光周期条件下 S lCO1表达模式相似 , 光照前期几乎检测不到其表达 , 随后表达增强 , 暗处理晚期转
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录水平已经下降到很低 (图 4, B、C)。由此可见 , S lCO1的表达呈现明显的生物钟调节特性 , 而光
周期对其表达趋势影响不大 , 这同拟南芥 CO基因表达模式 ( Putterill et al. , 1995) 相似。
3　讨论
拟南芥通过光受体感受光照的长短和强弱 , 形成昼夜节律。光周期途径的上游调控基因 (如
TOC1、LUX、FKF1等 ) 多属于昼夜节律类基因 , 它们感受昼夜变化而引起自身表达量的变化 , 最终
调控在叶中 CO的表达 (孙昌辉 等 , 2007)。CO基因是光周期调节拟南芥开花控制途径的下游关键
性组分之一 , 其表达受生物钟的精确调节。拟南芥、水稻和大豆等植物表现为不同的光周期习性 , 但
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都有 CO同源基因的存在 , 虽然彼此之间同源性较差 , 但在 CCT基序和 B 2box型锌指结构处高度保
守。依据 B 2box结构特点 , 拟南芥和水稻 CO 基因家族成员可以进一步分为 3类 , 第 1类包含两个
B2box结构 , 如 CO以及本试验所克隆的 S lCO1; 第 2类只有一个 B 2box结构 , 如拟南芥 COL6～COL8;
第 3类包含一个 B 2box结构和一个高度异化的 B 2box锌指结构 , 如拟南芥 COL9～COL15。植物 CO基
因是一个古老的基因家族 , 其家族成员的异化早于单子叶和双子叶植物进化上的分离。一些异源 CO
基因转入拟南芥 CO突变体中 , 可以使 CO突变体恢复到正常表型 , 而作为 CO的直接靶基因———FT
基因已经在多种植物中得到克隆 , 说明 CO在控制植物开花中的途径与功能是保守的 , 只是由于其他因
子的调控作用 , 导致产生不同的开花习性 (Robert et al. , 1998; L iu et al. , 2001; Yasue et al. , 2003)。
SlCO1蛋白含有 CO类似蛋白的保守结构域和保守氨基酸 , 其表达受生物钟调节 , 因此推测是一
个具有生物功能的 CO类似基因 , 但是否真正调节番茄开花 , 需要做进一步的功能互补和基因沉默验
证。以往对 CO的研究集中在典型的长日照或短日照植物上。番茄作为日中型植物 , 光周期对其开花
的影响较小。已经克隆的 TCO1的表达受生物钟调节 , 但并不能恢复拟南芥 CO 突变体表型。S lCO1
的克隆有助于进一步理解 CO类似基因在植物开花乃至其他生长发育途径中的作用。
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