全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 841 - 846
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 01 - 30; 修回日期 : 2008 - 05 - 13
基金项目 : 中德农业部科技合作项目 (06237) ; 国家 ‘十五’科技攻关项目 (2004BA516A09)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: chengzh@nwsuaf1edu1cn)
大蒜白腐病病原菌产毒素培养条件的优化
张林青 1, 2 , 程智慧 13
(1 西北农林科技大学园艺学院 , 陕西杨凌 712100; 2 淮阴工学院 , 江苏淮安 223001)
摘 　要 : 采用大蒜幼苗根系生长抑制率生物检测法 , 研究了大蒜白腐病病菌 (Sclerotium cepivorum ) 在
不同培养基、培养时间、培养温度、培养液 pH、光照和振荡培养等条件下粗毒素的活性和产量。结果表
明 : 大蒜白腐病病菌的最佳产毒培养基为 Fries液体培养基 , 培养温度为 1810 ℃, 培养基 pH值为 510, 黑
暗条件下连续振荡培养 6 d时产生的粗毒素的毒性最强。
关键词 : 大蒜 ; 白腐病病原菌 ; 培养条件 ; 粗毒素
中图分类号 : S 63314; S 436133　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620841206
O ptim iza tion of Cultur ing Cond ition s for Tox in Production by Sclero tium
cepivorum Berk. of Garlic
ZHANG L in2qing1, 2 and CHENG Zhi2hui13
( 1 College of Horticulture, N orthw est A & F U niversity, Yang ling, Shaanxi 712100, Ch ina; 2 Huaiyin Institu te of Technology,
Huaipian, J iangsu 223001, Ch ina )
Abstract: A test of crude toxin toxicity using garlic root inhibition was exam ined from toxin p roduction
related to culture medium , temperature, pH, culturing duration, light, dark or shaking conditions. Investiga2
tions concerned a garlic white rot pathogen, S clerotium cepivorum Berk. Results showed that op timum condi2
tions included using a Fries liquid medium at pH 510 and at 1810 ℃, with successive dark periods and sha2
king during culturing. Production of crude toxin reached the highest level on the 6 th day of culturing.
Key words: garlic; S clerotium cepivorum Berk. ; culturing condition; crude toxin
大蒜白腐病 (S clerotium cepivorum Berk. ) 是大蒜毁灭性病害 , 主要危害大蒜的根、鳞茎和叶 , 苗
期直接造成田间缺株死苗 , 严重地块绝收。目前 , 化学药物防治白腐病效果不明显 (Melero2Vara et
al. , 2000; 王转军 等 , 2004; 张根峰和张翼 , 2004)。大量用药还会降低产品食用安全性。要从根本
上解决白腐病 , 必须选育抗白腐病的大蒜品种。
病菌致病粗毒素在适当的选择剂量下可用于筛选高抗病水平的突变体 ( Yoder, 1983, 1990; 赵
蕾 等 , 2001; 赵明敏 等 , 2006)。为了明确毒素在病程中的作用和应用粗毒素进行细胞突变体筛选 ,
首先需要培养出大量的病菌粗毒素。
前人对小麦雪霉叶枯病菌、番茄早疫病病菌、棉花黄萎病菌、链格孢菌、大豆根腐病菌、立枯丝
核菌、马铃薯晚疫病菌的产毒研究表明 , 病原菌的产毒能力与培养基类型和环境条件密切相关 (左
豫虎 等 , 1996; 童蕴慧 等 , 1997; 吴蔼民 等 , 1999; 万佐玺 等 , 2001; 台莲梅和许艳丽 , 2004; 徐
敬友 等 , 2004; 邢宇俊和程智慧 , 2006)。但是 , 对于大蒜白腐病菌的产毒条件的系统研究迄今尚未
见报道。
本研究在分离大蒜白腐病病菌的基础上 , 探索了大蒜白腐病病菌产毒培养的条件 , 为今后进行大
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
蒜抗白腐病离体细胞筛选育种奠定基础。
1　材料与方法
111　供试菌种与粗毒素的提取
大蒜白腐病病菌菌种从在陕西杨凌大蒜田间具有典型白腐病症状的发病植株上分离纯化而来。病
原菌在进行液体培养前 3 d, 在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行活化培养 , 然后取长势一致的直径 5
mm菌饼接种培养。
将不同条件培养获得的白腐病病菌培养液先用 8层无菌纱布过滤 , 然后滤液用滤纸抽滤 , 得到无
菌滤液。将无菌滤液经 4 000 r·m in - 1离心 10 m in, 上清液经 0145μm的滤膜过滤 , 得到病原菌粗毒
素。
112　病菌产粗毒素培养条件的建立
11211　培养基和培养时间的筛选 　
试验设计以下 5种培养基。
(1) Fries培养基 : 蔗糖 30 g, 酒石酸铵 5 g, KH2 PO4 1 g, NH4 NO3 1 g, MgSO4 015 g, NaCl
011 g, 结晶 CaCl2 011 g, 酵母膏 1 g, 蒸馏水 1 000 mL。
(2) 理查德培养基 (R ichard medium) : KNO3 10 g, KH2 PO4 5 g, MgSO4 215 g, FeCl3 0102 g, 蔗
糖 50 g, 蒸馏水 1 000 mL。
(3) PS培养基 : 马铃薯 200 g, 蔗糖 20 g, 加水至 1 000 mL。
(4) PD培养基 : 马铃薯 200 g, 葡萄糖 20 g, 加水至 1 000 mL。
(5) 查彼克培养基 (Czapek2Dox medium ) : 蔗糖 30 g, KNO3 2 g, KH2 PO4 1 g, MgSO4 ·7H2 O
015 g, KCl 015 g, FeSO4 0101 g, 蒸馏水 1 000 mL。
分别在 5个 500 mL三角瓶中倒入 300 mL上述培养基 , 然后取菌丝饼 6块 , 接种于各液体培养基
中 , 重复 3次。在黑暗、1810 ℃、115 r·m in - 1振荡条件下培养。分别于培养 2、4、6、8、10、12 d
后取样制备大蒜白腐病病菌粗毒素。
11212　培养温度的筛选 　
设 9、12、15、18、21、24、27和 30 ℃等 8个培养温度处理。将 300 mL经筛选出的适宜培养基
倒入 500 mL三角瓶中 , 取菌丝饼 6块接种其中 , 分别置于不同温度的培养箱中 , 按筛选出的适宜时
间培养后取样制备大蒜白腐病病菌粗毒素。
11213　培养基 pH值的筛选 　
设 pH 310、410、510、610、710、810、910、1010等 8个培养基酸度处理。将 300 mL 经筛选出
的适宜培养基倒入 500 mL三角瓶中 , 取菌丝饼 6块接种于其中 , 按筛选出的适宜时间培养后取样制
备大蒜白腐病病菌粗毒素。
11214　光照条件和培养方式的筛选 　
将 300 mL 经筛选出的培养基倒入 500 mL三角瓶中 , 取菌丝饼 6块接种于其中。设 24 h光照 +
振荡、24 h光照 +静置、12 h光照 /12 h黑暗 +振荡、12 h光照 /12 h黑暗 +静置、24 h黑暗 +振荡、
24 h黑暗 +静置等 6个光照和振荡培养条件 , 按筛选出的适宜时间培养后取样制备大蒜白腐病病菌粗
毒素。
113　病原菌粗毒素的生物测定方法
选取大小一致的 30个蒜瓣置于光照强度 2 000 lx, 12 h光照 /12 h黑暗 , 白天温度 18 ℃ /晚上 12
℃的培养箱培养 30 d后 , 将幼苗取出 , 根稍加损伤 , 在 12 ℃粗毒素中处理 20 m in后重新栽种在培养
箱中保湿 24 h, 7 d后观察症状。
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　6期 张林青等 : 大蒜白腐病病原菌产毒素培养条件的优化 　
选取大小一致的 10个蒜瓣置于光照强度 2 000 lx, 光周期 12 h光照 /12 h黑暗 , 白天温度 18 ℃ /
晚上 12 ℃的培养箱培养 3 d, 转接于加入 8 mL待检测粗毒素的培养钵中 , 重新置于培养箱中培养 3 d
后观测根生长抑制率。根生长抑制率 ( % ) = (对照根平均长度 -处理根平均长度 ) /对照根平均长
度 ×100 (董金皋和朱日希 , 1992)。对照 (CK) 为无菌水。
114　数据统计与分析
每个处理重复 3次 , 所得数据用 DPS和 Excel软件分析。
2　结果与分析
211　病菌粗毒素对大蒜幼苗生长的影响
试验观察发现 : 大蒜幼苗接种粗毒素后 , 外叶从叶尖开始往下出现条状变黄 , 随后扩展到心叶及
叶梢 , 植株生长衰弱 , 整株变黄矮化或枯死。7 d后拔出病株 , 发现鳞茎表皮呈水浸状病斑 , 其症状
与田间大蒜白腐病典型病株相似 , 说明病菌粗毒素是致病因子。
212　培养基和培养时间对病菌产生粗毒素的影响
用大蒜根系进行生物检测 , 大蒜根系生长抑制率越高 , 说明产毒培养中病菌产生的粗毒素越多。
由表 1可以看出 , 在各培养基上 , 病菌的粗毒素产量与时间呈抛物线关系 , 在培养 6 d前粗毒素产量
随培养时间增加而递增 , 而 6 d后粗毒素产量随培养时间的增加而减少。病菌均在培养 6 d时产粗毒
素量最多。
表 1　病菌在不同培养基不同时间培养产生的粗毒素对大蒜根生长抑制率的影响
Table 1　Effect on inh ib ition of garlic root of crude tox in produced by the pa thogen for
d ifferen t culture m ed ium and cultur ing tim e
培养时间 / d
Culturing time
根生长抑制率 /% Inhibition of garlic root
PD培养基
PD medium
PS培养基
PS medium
Fries培养基
Fries medium
查彼克培养基
Czapek2Dox medium 理查德培养基R ichard medium
2 20129 ±2110 eE 22140 ±1165 dD 37150 ±1166 aA 25143 ±3170 bB 23110 ±1107 cC
4 45160 ±3144 eE 46176 ±2194 dD 78110 ±3110 aA 52108 ±4111 bB 49183 ±3172 cC
6 80160 ±3110 eD 87193 ±2136 cB 92148 ±2176 aA 88186 ±1129 bB 84160 ±4160 dC
8 75113 ±1103 eE 82143 ±2185 bB 89147 ±1166 aA 80140 ±2153 dD 78153 ±3189 dD
10 60147 ±3150 eD 72138 ±2154 bB 80161 ±1134 aA 67144 ±1120 cC 61169 ±0199 dD
12 37117 ±2106 eE 41128 ±1111 dD 76186 ±2113 aA 48147 ±1185 cC 50145 ±3145 bB
　　注 : 表中同一行数据后小写字母不同表示 5%水平的差异显著性 , 大写字母不同表示 1%水平的差异显著性 , 相同字母表示差异
不显著。
Note: Cap ital letters rep resent differences at 1% level within a row and small letters rep resent differences at 5% level within a row. The same
letters mean no significant difference.
不同培养基上产毒有极显著的差异。在 Fries培养基上培养病菌 6 d产毒量最多 , 大蒜根生长抑
制率最高 , 达 92148% ; 而在 PD培养基、PS培养基、查彼克培养基、理查德培养基上培养 6 d所产
生的粗毒素较少 , 根生长抑制率分别为 80160%、87193%、88186%和 84160%。从产毒趋势上也可
以看出 , 在相同培养时间下 , Fries培养基上产生的毒素使大蒜根生长抑制率极显著高于其他培养基
( P < 0101)。
可见 , Fries培养基是最适合大蒜白腐菌产毒的培养基 , 产生毒力最强的培养时间是 6 d。
213　培养温度对病菌产生粗毒素的影响
病菌在不同温度下培养产毒差异很大。由图 1可以看出 , 在培养温度低于 18 ℃时 , 粗毒素产量
随着温度的升高而增加 ; 温度高于 18 ℃时 , 粗毒素产量随着温度的升高而降低。在 18 ℃培养条件下
产毒量最多 , 大蒜的根生长抑制率最高 , 达 94113% ; 12 ℃和 15 ℃培养条件下产毒量也较多 , 大蒜
的根生长抑制率分别为 87145%和 90138% ; 虽然 9、12、15、21、24、27和 30 ℃温度下培养产生的
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毒素对大蒜根生长有不同程度的抑制 , 但抑制率均极显著低于 18 ℃产毒培养 ( P < 0101)。由此可
见 , 适宜产毒的培养温度范围是 12～18 ℃, 其中在 18 ℃下产毒量最多 , 毒性最强。
214　 pH对病菌产粗毒素的影响
由图 2可见 , 病菌培养液 pH对病菌产毒影响很大 , 培养基 pH与粗毒素产量呈抛物线关系。培
养基 pH低于 510时 , 粗毒素产量随着培养基 pH升高而增加 ; 培养基 pH高于 510时 , 粗毒素产量随
着培养基 pH 升高而减少。pH 510～610的培养基产毒量较大 , 根生长抑制率分别为 92195%和
90115%。而 pH 1010时产毒最少 , 此时检测大蒜根生长抑制率仅为 40113%。
方差分析表明 pH 510时培养产生的毒素使大蒜根生长抑制率极显著高于其它处理 ( P < 0101) ,
因而认为 , 在培养病菌时培养基 pH为 510对产毒最有利。
215　光照条件和振荡培养方式对病菌产生粗毒素的影响
表 2表明 , 24 h黑暗 +振荡条件下培养产生的毒素毒性最强 , 培养 6 d后检测对大蒜根生长抑制
率为 93150% ; 而 12 h光照 /12 h黑暗 +静置条件下产生的毒素毒性最低 , 对大蒜根生长抑制率为
77147%。24 h光照 +振荡、24 h光照 +静置、12 h光照 /12 h黑暗 +振荡和 24 h黑暗 +静置条件下
产生的毒素对大蒜根生长抑制率分别为 86123%、77183% 、88167%和 84117%。说明振荡较静置有
利于产毒 , 黑暗较光照有利于产毒。在连续黑暗和振荡条件下产生的毒素对大蒜根生长抑制率极显著
高于其它处理 ( P < 0101)。由此可见 , 24 h黑暗 +振荡条件适合该病菌产毒。
表 2　不同光照及振荡条件下培养病菌产生的粗毒素对大蒜根生长抑制率的影响
Table 2　Effect on inh ib ition of garlic root of crude tox in produced by the pa thogen in
d ifferen t lighting and shak ing cond ition s
处理
Treatment
根系生长抑制率 /%
Inhibition of garlic root
24 h光照 +振荡 24 h light + shaking 86123 ±1108 cBC
24 h光照 +静置 24 h light + remaining static 77183 ±1161 eD
12 h光照 /12 h黑暗 +振荡 12 h light /12 h dark + shaking 88167 ±2140 bB
12 h光照 /12 h黑暗 +静置 12 h light /12 h dark + remaining static 77147 ±1153 eD
24 h黑暗 +振荡 24 h dark + shaking 93150 ±3119 aA
24 h黑暗 +静置 24 h dark + remaining static 84117 ±1174 dC
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　6期 张林青等 : 大蒜白腐病病原菌产毒素培养条件的优化 　
3　讨论与小结
病原菌在人工培养基内产生毒素直接受培养基成分和外界环境条件的影响。国内外有许多这方面
的研究报道。如 Zhang等 (1997) 在研究 Pyrenophora tritici2repen tis产生的 PTR 毒素时 , 就采用了变
温、变换光照及暗处理时间、更换培养基等多种手段来促使其产毒。
培养基直接影响病菌的产毒量。M iller ( 1983 ) 的研究表明 , 禾谷镰刀菌可以在 MYROTT和
MOSS液体培养基中产生 DON毒素 , 而在马铃薯液体培养基中则不产生。改良 R ichard培养液适宜水
稻纹枯病菌和立枯丝核菌产毒 (徐敬友 等 , 2004) , 适宜大豆根腐病菌产毒的培养基是 PSC (台莲梅
和许艳丽 , 2004)。
环境因素方面 , Pathre和 M iroeha (1978) 认为低温 (12～15 ℃) 有利于禾谷镰刀菌产毒 , M iller
(1983) 认为 pH 7～8时禾谷镰刀菌产生的毒素量最多。吴蔼民等 (1999) 报道 , 不同培养时间的棉
花黄萎病菌毒素产量相差很大 , 培养 8 d的产毒量仅为培养 14 d的 1 /3。万佐玺等 (2001) 确定了有
利于链格孢菌产毒的温度为 25 ℃, pH值为 4113, 培养时间为 5～7 d、黑暗及静置等培养条件。而
适宜晚疫病粗毒素培养条件为 , 温度 20～22 ℃, pH 610～710, 黑暗条件振荡培养 (邢宇俊和程智
慧 , 2006)。可见适宜的培养条件对毒素高产有很大作用。
本研究从田间发病的典型病株分离出白腐病菌 , 回接鉴定表明病菌具有正常的致病性 , 大蒜白腐
病菌可产生有致病力的粗毒素 , 粗毒素能引起大蒜白腐病症状。进一步研究大蒜白腐病菌的产毒条
件 , 结果如下 :
(1) 培养基对大蒜白腐病菌的产毒影响很大 , 在 PD、PS、 Fries、Czapek2Dox、R ichard 5种液体
培养基中 , 以 Fries培养基最适于产毒培养。
(2) 在 2～12 d培养时间范围内 , 病菌毒素毒力最强的培养时间是 6 d。原因可能是白腐病菌一
般 6～7 d形成菌核 , 不再分泌毒素。
(3) 在 9～30 ℃的培养温度范围内 , 适宜产毒的培养温度范围是 15～18 ℃, 其中在 18 ℃下产
毒量最多 , 毒性最强。
(4) 培养期培养液 pH 510～610适合产毒 , 最适 pH值为 510。
(5) 在连续黑暗振荡培养条件下培养有利于该病菌产毒。
本研究证实了大蒜白腐病菌毒素的致病性 , 明确了大蒜白腐病菌的产毒条件 , 为毒素的纯化和进
一步深入研究其理化特性、活性组分、致病机理及利用毒素进行抗病品种筛选提供了理论基础。
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