全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 艺 学 报 2006, 33 (3) : 544～548
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 07 - 07; 修回日期 : 2006 - 01 - 17
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30370981, 30471188, 30400298) ; 中荷联合园艺作物基因组技术实验室项目 ; 农业部蔬
菜遗传与生理重点开放实验室项目3 通讯作者 Author for correspondence
利用 cDNA2AFL P检测甘蓝雄性不育相关基因的时
序性表达
康俊根 1, 2 王晓武 13 张国裕 1 张延国 1 娄 平 1 方智远 1
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 山西省农业科学院蔬菜研究所 , 山西太原 030031)
摘 要 : 通过 cDNA2AFLP技术分别对 4种具有不同败育时期特征的甘蓝雄性不育材料和遗传背景一致
的可育材料进行分析 , 揭示了 4种不育类型育性相关基因的时序性表达特征 , 并对 4种育性相关基因分别
选取 1个转录表达片段 ( TDFs) 克隆测序。结果表明 , 获得的 113条不同表达方式 TDFs可分为 12种模
式 : 其中按照不同雄性不育败育顺序表达中断的有 A、B、C、D 4种模式 , 分别代表造孢细胞期、花粉母
细胞期、四分体前期和四分体后期发育中断的育性相关基因。这 4种表达模式包括 76条 TDFs, 占总 TDFs
的 67125%。结合发育中断模型和序列分析结果 , 推测糖基水解酶家族基因、具有 VQ结构域的基因、富含
甘氨酸蛋白和促进游离小孢子解离的果胶裂解酶基因可能分别参与上述花药发育 4个时期雄性育性的建成。
关键词 : 甘蓝 ; 花药发育 ; cDNA2AFLP; 基因表达
中图分类号 : S 63511 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0320544205
Sequen tia l Expression of Fertility2rela ted Genes D etected by cD NA2AFL P in
D ifferen t Types of Cabbage M a le Ster ile L ines
Kang Jungen1, 2 , W ang Xiaowu13 , Zhang Guoyu1 , Zhang Yanguo1 , Lou Ping1 , and Fang Zhiyuan1
(1 Institu te of V egetable and F low ers, Ch inese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, China; 2 Institu te of V egetable,
Shanxi A cadem y of A gricu ltura l Sciences, Taiyuan, Shanxi 030031, Ch ina)
Abstract: Elucidating the gene exp ression in anther development is one of the key step s to develop new
types of male sterility. Four types of male sterile cabbage lines and their corresponding fertile lines were used
to analyze the gene exp ression by cDNA2AFLP. In total, we got 113 differentially exp ressed TDFs, which were
classified into 12 group s. Among them, 76 TDFs (67125% of the total) were classified into group A , B , C
and D, which were sequentially interrup ted according to the different sterile stages in four male sterile lines.
Sequence analysis of rep resentative TDFs from each group showed that glycosyl hydrolase fam ily 1 p rotein, VQ
motif2containing p rotein, glycine2rich p rotein and pectate lyase fam ily p rotein possibly involved in sporogenesis
cell, pollen mother cell, p re2tetrad and post2tetrad stage male development respectively.
Key words: Cabbage; Anther development; cDNA2AFLP; Gene exp ression
我国在甘蓝类作物雄性不育方面的研究有较长的历史 , 研究较多的包括隐性雄性不育、黑芥胞质
雄性不育、萝卜胞质雄性不育和显性雄性不育〔1, 2〕。阐明甘蓝雄性不育相关基因在花药不同发育时期
表达的分子机理 , 是进一步寻找和创造新不育源并最终实现人工调控甘蓝雄性育性的前题。
鉴定发育相关基因时序性表达的前提是获得具有不同发育时期表型代换突变体并明确其功能缺
失。卞春松等曾对甘蓝雄性不育败育类型进行了较为全面的细胞学比较研究〔3〕, 表明不同雄性不育
类型具有不同的花粉败育特点 , 败育发生在不同的花粉发育时期 , 其中黑芥不育 (N iCMS) 败育发生
在造孢细胞发育时期 , 隐性不育 (M s2cr1) 败育发生在花粉母细胞减数分裂时期 , 萝卜胞质不育
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3期 康俊根等 : 利用 cDNA2AFLP检测甘蓝雄性不育相关基因的时序性表达
(OguCMS) 败育发生在四分体前期 , 显性不育 (M s2cd1) 败育发生在四分体后期 (表 1)。4种不育
类型的不同败育时期为进行甘蓝雄蕊发育的基因时序性表达研究提供了天然的发育时期划分标尺。
cDNA2AFLP ( cDNA Amp lified Fragment Length Polymorphism ) 是在 AFLP基础上发展起来的一种
高通量基因表达研究技术〔4〕, 具有成本低 , 可重复性高和假阳性率低的优点〔5〕, 同时由于其具有较
高的多态性显示效率 , 可以在没有相关基因信息的情况下同时进行多个样品基因表达的高通量分析 ,
系统地研究发育过程中基因表达和基因间的相互作用〔6〕, 已经广泛应用于植物生长发育及转录图谱
构建等领域的研究 〔7, 8〕。作者利用 cDNA2AFLP技术在转录水平上同时对 4种具有不同时期败育特征
的甘蓝雄性不育类型进行全面的基因表达分析 , 以期确定与育性形成相关基因的时序性表达特征 , 进
而探明控制甘蓝雄性不育花粉败育的机理 , 为深入开发利用甘蓝不同的雄性不育类型提供理论依据。
1 材料与方法
111 试验材料花蕾混合样品池的建立
以中国农业科学院蔬菜花卉研究所经多代回交获得的甘蓝 4种雄性不育类型及其对应的可育近等
基因系为试材 (表 1) , 2004年春季种株开花后 , 取每一个株系的完整花序以供试验。采用花蕾混合
取样的策略 , 即选取不同雄性不育类型材料及其对应的可育近等基因系 , 当第 1朵花开放时 , 从花序
最低端花蕾开始取样 , 一直到花序顶端的所有花蕾。将同一株系 3个单株花序的花蕾分别混合构建各
种雄性不育类型不育池和可育池共 7个 , 代号分别为 803K, 803B , 802K, 802B , 633, 751, 768。
表 1 7个池中材料的背景来源及育性
Table 1 Background of the ma ter ia ls in 7 D NA pools
试材代号
Pool labels
来源自交系
O riginal lines
育性
Fertility
雄性不育类型
MS types
败育时期
Stage at which male sterility occurs
803K 803 可育 Fertile - -
803B 803 不育 Sterile 黑芥胞质不育 N iCMS 造孢细胞期 Sporogenesis cell
802K 802 可育 Fertile - -
802B 802 不育 Sterile 隐性不育 M s2cr1 花粉母细胞期 Pollen mother cell
633 633 可育 Fertile - -
751 633 不育 Sterile 显性不育 M s2cd 1 四分体前期 Pre2tetrad
768 633 不育 Sterile 萝卜胞质不育 OguCMS 四分体后期 Post2tetrad
112 RNA提取与双链 cD NA的合成
花蕾总 RNA提取采用 Trizol试剂盒 , 并参照其说明书进行。总 RNA 用 RQ1 RNase2free DNase
( Promega) 37℃处理 30 m in后用于 cDNA合成。采用 M 2MLV RTase cDNA synthesis kit ( Takara) 并参
照试剂盒说明书合成双链 cDNA, 使用氯仿抽提纯化 , 最后溶于 20μL DEPC水中。
113 cD NA2AFL P差异显示
cDNA2AFLP分析体系及程序参照文献 〔9〕。利用 A se I和 Taq I双酶切组合 , 选择性扩增引物使用
远红外荧光 IRD2700和 IRD2800标记的加 2个选择性碱基的 Ase I引物 (8个 ) 和非荧光标记的 Taq I引
物 (16个 ) , 共 128个引物组合进行差异表达显示。
由于每种不育类型均有与其除育性外其它遗传背景完全一致的可育系作对照 , 不育材料和可育材料
之间多态性差异基本可以认定为育性相关差异。其中只有在 cDNA2AFLP指纹图谱上全部可育池有带 ,
而不育池条带存在差异才被认为是育性相关的候选表达片段 ( Transcrip t derived fragments, TDFs)。
114 差异片段回收及克隆测序
差异表达片段回收纯化后克隆至 PMD 182T载体 ( Takara) 上送商业公司测序。经测序后的序列
数据去除质粒序列和引物序列后在拟南芥 EST数据库 ( http: / /www1arabidop sis1com ) 进行 B lastn N
列比对和功能预测。
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2 结果与分析
211 差异表达的多态性分析
所有 128个引物组合共扩增出约 9 000条清晰可辨的条带 , 其中 (图 1) 7个池中均存在的非差
异带约占总条带的 49135% , 这些带颜色较深 , 表达量较高 , 可能来源于一些非育性相关基因或未被
4种雄性不育类型阻断的基因 (N I型 )。多态性带中有 3条带均表现为所有可育池中无带而不育池中
有带 , 这 3条带可能代表上调表达的基因。所有可育池中有带而不育池中表现不同多态性条带的有
113条 , 占所有扩增出条带的 1126% , 分析认为这些条带是和甘蓝雄性育性相关的 TDFs。
图 1 4种甘蓝雄性不育及可育池 cD NA2AFL P差异显示图谱及 A、B、C和 D 4种差异表达类型
1. 803K (可育池 ) ; 2. 803B (黑芥胞质不育池 ) ; 3. 802K (可育池 ) ; 4. 802B (隐性不育池 ) ;
5. 633 (可育池 ) ; 6. 751 (显性不育池 ) ; 7. 768 (萝卜胞质不育池 )。M. 0～800 bp荧光专用 Marker.
A16T21, A16T22, A16T23, A16T26为不同引物组合。
F ig. 1 cD NA2AFL P prof ile of 4 cabbage ma le ster ilities. Boxed pa ttern s correspond to A, B, C and D expression m odels
1. 803K ( Fertile) ; 2. 803B (N iCMS) ; 3. 802K ( Fertile) ; 4. 802B (M s2cr1) ; 5. 633 ( Fertile) ;
6. 751 (M s2cd1) ; 7. 768 (Ogu CMS). M rep resents 0 - 800 bp fluorescence marker. A16T21,
A16T22, A16T23 and A16T26 rep resent different p rimer combinations.
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3期 康俊根等 : 利用 cDNA2AFLP检测甘蓝雄性不育相关基因的时序性表达
212 差异表达 TD Fs模型分析
本研究检测到的 113条 TDFs根据其多态性的
不同可分为 A ～L 12种表达模式 (表 2)。经分
析 , 所有下调表达的育性相关 TDFs中 , 符合不
同雄性不育类型败育顺序特征的 A、B、C、D 4
种 TDFs (图 1, A、B、C、D) 共计 76条 , 占总
育性相关 TDFs的 67125%。其中较早表达的 A型
基因占 26155% , 中早期表达的 B 型基因占
17170% , 中期表达的 C型和较晚表达的 D型基
因分别占 11150%。
213 4种顺序表达育性相关基因的序列分析
为了进一步探索 4种符合不同发育时期表达
的育性相关基因的基因信息 , 分别选取 A、B、
C、D 4种表达类型中的一条 TDFs克隆测序后在
拟南芥 EST数据库进行 B last N分析。A型 TDFs
表 2 TD Fs表达模式及数量
Table 2 The expression pa ttern s of the TD Fs and num ber
TD Fs for each pa ttern
表达模式
Exp ression
model
差异类型 3
D ifferential exp ression patterns
N iCMS M s2cr1 OguCMS M s2cd1 TDFs数量TDFsnumber 百分率Percentage( % )
A - + + + 30 26155
B - - + + 20 17170
C - - - + 13 11150
D - - - - 13 11150
E + - + + 14 12139
F - - + - 13 11150
G - + + - 2 1177
H + + + - 2 1177
I + - + - 3 2165
J - + - - 1 0189
K + - - - 1 0189
L - + - + 1 0189
3 为在 cDNA2AFLP指纹图谱上不同不育池的多态性表现 ,
+ 表示有带 , - 表示无带。 3 Refers to the p resence ( + ) or ab2
sence ( - ) of bands in different sterility cDNA pools.
序列 MS1626210推测为造孢细胞时期表达的基因。其序列与 B. rapa花蕾 cDNA克隆 L4786611高度
同源 , 相似性达 98% , 进一步以此序列与拟南芥 EST数据库进行 B last N分析 , 其编码一个糖基水解
酶家族蛋白 , E值为 2100E211。B型 TDFsMS1626150推测为小孢子母细胞发育时期表达的基因 , 与
拟南芥基因 A t3g56880同源 , E值为 1140E207。其表达的蛋白具有 VQ结构域 , 但在拟南芥中的功能
未知。C型 TDFs S1623250推测为减数分裂后期至四分体前期表达的基因 , 先与 B rassica EST数据库
同源性比对 , 其与 B. napus花蕾 cDNA克隆 CX187550序列相似性达 99% , 与拟南芥数据库编码 GRP
( Glycine2rich p rotein) 蛋白的基因 A t1g76965有同源性 , E值为 6110E203。D型 TDFsMS1514173序列
分析与拟南芥果胶裂解酶基因 A t3g01270高度同源 , E值为 515E217。
3 讨论
本研究应用 128个引物组合 , 共获得约 9 000条转录条带 , 如果全部应用 256个引物组合约可获
得 18 000条转录条带 , 这与 W illing等〔10〕估计花药中有 20 000条转录本的结果相近。因此可以认为
试验较为全面地代表了雄蕊发育过程中不同时期表达的转录本的数量。为了保证试验的可靠性 , 在本
试验 cDNA2AFLP差异表达分析时仅对在可育池中有带而在不育池中无带的 113条多态性带作为育性
相关基因进行进一步的研究 , 实际上不仅可以分析不同发育时期基因的表达 , 还相当于进行了 4次重
复验证 , 大大提高了所获得育性相关基因的可靠性。另外获得 3个所有可育池均无带 , 但所有不育池
均有带的上调表达的 TDFs (U型 )。说明雄性不育的发生不仅表现为大量育性相关基因的发育中止 ,
还有少部分上调表达的基因。
我们根据以上所研究的与育性相关 (包括 A、B、C和 D 4种表达模式 ) 的基因和不同败育时期
的对应关系 , 提出了甘蓝不同雄性不育类型发育中断顺序模型 (图 2) , 初步揭示了花药发育过程中 ,
多数基因表现为线性模型在不同时期顺序表达。结合不同材料败育时期特征分析认为这些基因的表达
具有典型的顺序发育特征 , 即下一时期表达的基因依赖于前一时期基因的正常表达 , 如果前一时期基
因的表达中断 , 则下一时期表达的基因也失去了表达的基础。结合发育中断线性模型和序列分析结
果 , 推测糖基水解酶家族基因、具有 VQ结构域的基因、富含甘氨酸蛋白和促进游离小孢子解离的果
胶裂解酶基因 , 可能分别参与造孢细胞时期、小孢子母细胞发育时期、四分体前期和四分体后期雄性
育性的建成。目前人们对雄蕊发育不同基因的时序性表达研究较少 , 这些基因已有的功能注释中表达
时期未知 , 我们尚需通过 RT2PCR等技术进行进一步的表达时期分析。
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图 2 甘蓝不同雄性不育类型发育中断顺序模型
灰色柱表示正常发育时期 , 黑色柱表示发生败育时期。N I表示未发育中断的基因 , A、B、C、D表示在不同败育时期表达的
基因。黑线下为不同时期表达的基因在 cDNA2AFLP指纹图谱上不同不育池的多态性表现 , 顺序依次为 N iCMS, M s2cr1,
OguCMS, M s2cd1, +表示有带 , - 表示无带。
F ig. 2 Sequen tia l developm en t in terruption m odels in d ifferen tM S types of cabbage
Gray bar rep resents the normal developmental stage. B lack bar rep resents the male sterility stage. N I rep resents the stage in
which the genes were not interrup ted in all of four types of male sterilities. A, B, C and D rep resent the exp ressed genes in different
anther development stages , which were classified by the developmental interrup tions of N iCMS, M s2cr1, OguCMS, M s2cd1.
‘ + ’ rep resent band p resence and‘ - ’rep resent band absence.
综上所述 , 不论是胞质不育还是核不育类型 , 各种不同的雄性不育类型其不育基因均是通过正向
或负向调控一系列下游细胞核基因的表达 , 具备明显的顺序调控特征。但是本研究还检测到不能用该
模型解释的其它 8种表达类型的 TDFs, 占总 TDFs的 32175% , 这些表达类型表明花药的发育过程可
能还存在其它旁路调控网络。进一步的研究正在进行中。
参考文献 :
1 方智远 , 刘玉梅 , 杨丽梅 , 王晓武 , 庄 木 , 张扬勇 , 孙培田. 我国甘蓝遗传育种研究概况. 园艺学报 , 2002, 29 (增刊 ) : 657～663
Fang Z Y, L iu Y M, Yang L M, W ang X W , Zhuang M, Zhang Y Y, Sun P T. A survey of research in genetic breedings of cabbage in
China. Acta Horticulturae Sinica, 2002, 29 ( Sup l. ) : 657～663 ( in Chinese)
2 方智远 , 孙培田 , 刘玉梅 , 杨丽梅 , 王晓武. 甘蓝显性雄性不育系的选育及其利用. 园艺学报 , 1997, 24 (3) : 249～254
Fang Z Y, Sun P T, L iu Y M, Yang L M, W ang X W. Development of dom inant male sterile lines and hybrid seed p roduction in cabbage
(B rassica oleracea var. capita ta) . Acta Horticulturae Sinica, 1997, 24 (3) : 249～254 ( in Chinese)
3 卞春松. 几份不同遗传类型甘蓝雄性不育花药发育的细胞形态学研究 : 〔硕土论文〕. 北京 : 中国农业科学院 , 1994. 1～16
B ian C S. Cytomorphological studies on anther development of four male sterile lines in B rassica oleracea var. capita ta: 〔Master D isserta2
tion〕. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 1994. 1～16 ( in Chinese)
4 Bachem C W B, Hoeven R S, B ruijn S M, V reugdenhil D, Zabeau M, V isser R. V isualisation of differential gene exp ression using a novel
method of RNA fingerp rinting based on AFLP: analysis of gene exp ression during potato tuber development. The Plant Journal, 1996, 9:
745～753
5 Pardee A B, McClelland M. Exp ression genetics: differential disp lay. W estborough, MA, USA: Eaton Publishing, 1999. 488p
6 Donson J, Fang Y, Esp iritu2Santo G, XingW , Salazar A, M iyamoto S, A rmendarez V, Volkmuth W. Comp rehensive gene exp ression analy2
sis by transcrip t p rofiling. PlantMolecular B iology, 2002, 48: 75～97
7 Bachem C W B, Horvath B, Trindade L, ClaassensM, Davelaar E, JordiW , V isser RG. A potato tuber2exp ressed mRNA with homology to
steroid dehydrogenases affects gibberellin levels and p lant development. The Plant Journal, 2001, 25 (6) : 595～604
8 B rumans B, Carmen A F, Bacehem C W B, Eck H J, V isser R G. A novel method for the construction of genome wide transcrip tome map s.
The Plant Journal, 2002, 31 (2) : 211～222
9 娄 平 , 王晓武 , Guusje Bonnema, 方智远. 利用 cDNA2AFLP技术克隆鉴定甘蓝显性核不育相关基因表达序列. 园艺学报 , 2003,
30 (6) : 668～672
Lou P, W ang X W , Guusje Bonnema, Fang Z Y. Gene exp ression associated with dom inantmale sterility in cabbage is revealed by cDNA am2
p lified fragment length polymorphism analysis. Acta Horticulturae Sinica, 2003, 30 (6) : 668～672 ( in Chinese)
10 W illing R P, Bashe D, Mascarenhas J P. An analysis of the quantity and diversity of messenger RNA s from pollen and shoots of Zea m ays.
Theoretical and App lied Genetics, 1988, 75: 751～753
845