全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (4) : 501 - 508
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 10 - 15; 修回日期 : 2008 - 03 - 10
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30471203)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: luozhr@mail1hzau1cn)
罗田甜柿 Ty12copia类逆转座子 RNa seH2L TR序列
的分离和特性分析
杜晓云 , 张青林 , 罗正荣 3
(华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 , 武汉 430070)
摘 　要 : 逆转座子序列信息的获得 , 对了解其在基因组中的行为及系统学研究有重要价值。本试验从
罗田甜柿 (D iospyros kak i Thunb.‘Luotian2tianshi’) 基因组中分离出 31个 RNaseH2LTR ( long term inal repeat,
长末端重复 ) 序列 , 并利用逆转座子间扩增多态性 ( inter2retrotransposon amp lified polymorphism, IRAP) 技
术对部分序列相应的逆转座子家族在柿属植物中的转座活性及分布情况进行初步探讨。序列分析结果表明 ,
至少有 10个 Ty12copia类逆转座子家族得到扩增 ; 其家族间普遍表现高度异质 , 碱基替换、插入或缺失突
变 , 以及翻译成氨基酸后发生不同程度的终止密码子突变、氨基酸取代和移框突变等 , 是产生高异质性的
原因 ; 此外 , 其家族内部某些序列间的相似性极高 , 可能是寄主基因组与逆转座子间互惠关系的体现。应
用部分逆转座子引物的 IRAP分析结果表明 , 相应的逆转座子家族在柿属植物中普遍存在 , 其分布广泛 ,
拷贝数高 , 转座活性强 , 具有进一步开发为多种逆转座子分子标记的潜力。
关键词 : 柿 ; Ty12copia逆转座子 ; 抑制 PCR; 长末端重复 ; 逆转座子间扩增多态性
中图分类号 : S 66512　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0420501208
Isola tion and Character iza tion of RNa seH2L TR Sequences of Ty12copia L ike
Retrotran sposon s in O r ien ta l Persimm on ( D iospyros kaki Thunb. ‘L uotian2
tian sh i’)
DU Xiao2yun, ZHANG Q ing2lin, and LUO Zheng2rong3
( Key Laboratory of Horticu ltura l P lant B iology, M inistry of Education, Huazhong A gricultural U niversity, W uhan 430070,
China)
Abstract: It is important to obtain sequence information on retrotransposons for detecting their behavior
in the host genome and for studing the phylogenetic relationship in many crop s. Thirty2one RNaseH2long term i2
nal repeat (LTR) sections of the Ty12copia like retrotransposon clones were isolated from oriental persimmon
(D iospyros kaki Thunb. ‘Luotian2tianshi’) successfully, and IRAP ( inter2retrotransposon amp lified polymor2
phism ) analysis were performed in order to illustrate retrotransposon group s corresponding to several sequences
transcrip tional activity and distribution in oriental persimmon genome. Both sequence multip le alignment and
the phylogenetic analysis indicated that at least ten subgroup s were amp lified, and high sequence heterogeneity
that was due to nucleotide rep lacement, insertion or deletion and am ino acid rep lacement, stop codon and
frameshift mutations in translated putative am ino acid sequences were found among the different subgroup s.
But some clones showed high sim ilarity within the same subgroup, it may exhibit the mutual benefit relation2
ship between the host genome and retrotransposons. The IRAP analysis suggested that retrotransposon were u2
biquitous, generally dispersed, high copy and high transcrip tional activity in D iospyros spp. , and their multi2
p le insertion patterns indicated that the potential of these RNaseH2LTR sequences for develop ing novel retro2
transposon molecular markers.
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
Key words: D iospyros kaki Thunb. ; Ty12copia retrotransposon; supp ression PCR; long term inal re2
peat; inter2retrotransposon amp lified polymorphism
柿 (D iospyros kak i Thunb. ) 在植物学分类上属于单一种 , 但种内变异十分丰富 , 如分布于大别
山区的完全甜柿种质 ———罗田甜柿中 , 就发现诸多变异类型 (罗正荣 等 , 1996)。前人已从形态学、
细胞学、同工酶和常规分子标记等方面对柿的遗传多样性及完全甜柿进化途径进行过研究 ( Tao &
Sugiura, 1987; Yamada et al. , 1993; Kanzaki et al. , 2000; 杨勇 等 , 2003; Guo & Luo, 2006; Guo
et al. , 2006; Hu & Luo, 2006) , 但因自然环境和标记数量等限制 , 使得其在用于遗传背景相似的种
质鉴定、遗传多样性和进化等研究中的灵敏度和真实性受到很大影响。
逆转座子是真核生物中种类最多、分布最广的转座因子 , 它以 RNA为媒介保留母本 DNA进行转
座 , 是植物核基因组的重要组成部分 ( Kumar & Bennetzen, 1999)。在其纵向和横向传递中产生的高
异质性和高拷贝数 , 以及因外界生物和非生物因素刺激被差异激活而发生转座所导致的遗传变异 , 是
植物遗传多样性形成的一个重要因素。因此 , 逆转座子被看作是研究植物遗传多样性和进化的理想工
具 ( Kumar & Bennetzen, 1999)。近年来 , 基于逆转座子已开发出系列分子标记 , 并在许多领域得到
广泛应用 ( Kalendar et al. , 2000; B retóet al. , 2001; Berenyi et al. , 2002; Antonius2Klemola et al. ,
2006; Guo et al. , 2006; Bousios et al. , 2007)。逆转座子包括长末端重复序列 ( long term inal repeat,
LTR) 和非长末端重复序列 (Non2LTR) 两类。Ty12copia是目前所知数量最大的一类 LTR逆转座子 ,
其结构中的 LTR含有转录起始和终止信号以及各种调控序列 , 在逆转座过程中指导 mRNA 合成 ; 若
随逆转座子插入植物基因附近或基因内部 , 则可通过调控基因表达导致基因突变 ; LTR序列相对保守
但又存在一定程度的变异 , 是目前逆转座子分子标记中用作引物开发的理想靶位点。此外 , 逆转座子
结构中的 PPT ( PolyPurine Tract, 多聚腺苷酸 , 作为引发第二条 DNA链合成的必备引物 ) 用于系统学
研究 , 目前已有成功报道 ( Ellis et al. , 1998)。
本试验中拟对罗田甜柿 Ty12copia类逆转座子中 RNaseH2LTR序列的特点及其相互关系进行研究 ,
并利用 IRAP ( inter2retrotransposon amp lified polymorphism, 逆转座子间扩增多态性 ) 分子标记对部分
序列对应的逆转座子家族在柿属植物中的转座活性及分布情况进行了初步探讨 , 以期为进一步开发相
关分子标记以及开展遗传多样性检测和完全甜柿起源等研究提供科学依据。
1　材料与方法
111　材料
试材为罗田甜柿 (D iospyros kak i Thunb. ‘Luotian2tianshi’, 完全甜柿 , 2n = 6x = 90, 原产湖北省
罗田县 )、富有 (D. kaki Thunb. ‘Fuyuu’, 完全甜柿 , 2n = 6x = 90, 原产日本 )、磨盘柿 (D. kaki
Thunb. ‘Mopanshi’, 完全涩柿 , 2n = 6x = 90, 原产中国 )、禅寺丸 (D. kak i Thunb. ‘Zenjimaru’,
不完全甜柿 , 2n = 6x = 90, 原产日本 )、平核无 (D. kaki Thunb. ‘H iratanenashi’, 不完全涩柿 ,
2n = 9x = 135, 原产日本 )、君迁子 (D. lotus L. , 2n = 2x = 30) 以及老鸦柿 (D. rhom bifolia Herosl. ,
2n = 4x = 60)。其中 , 罗田甜柿用于分离 Ty12copia类逆转座子 RNaseH2LTR 序列 , 其它试材用于
IRAP分子标记预检测。所有试材均采自华中农业大学柿圃。
112　方法
11211　RNaseH2LTR 序列的分离、测序及序列分析 　按 Luo 等 ( 1995 ) 方法提取基因组 DNA。
RNaseH2LTR序列分离采用抑制 PCR方法 , 具体技术流程参考 Lavrentieva等 (1999) 的稍作改进。抑
制 PCR中进行基因组酶切的两个 4碱基平端限制性内切酶为 HaeⅢ或 SspⅠ ( TaKaRa, Japan) ; 逆转
座子 RNaseH酶基因特异引物参考 Pearce等 (1999) 的稍作修改。接头序列 ( ad21、 ad22)、接头引
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　4期 杜晓云等 : 罗田甜柿 Ty12copia类逆转座子 RNaseH2LTR序列的分离和特性分析 　
物序列 (AP1、AP2) 及逆转座子的 RNaseH酶基因特异引物序列 ( SSP1、SSP2) 见表 1; 所用引物
均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR产物连接于 pMD182T载体 ( TaKaRa, Japan) ,
转化、筛选、阳性克隆鉴定后 , 由北京三博远志生物技术有限公司完成序列测定。采用 DNA Star 510
推断 RNaseH酶的氨基酸序列 , 并进行同源性比较分析 ; Clustal W 118用于排序比对 ; B ioEdit 710编辑
序列 ; Mega 310对 RNaseH2LTR序列构建系统进化树 , 系统树各分支的置信度由自展值 1000循环检验。
表 1　引物及接头序列
Table 1　O ligonucleotides used a s adapters and pr im ers
接头 /引物 Adap ter/p rimer 序列 (5′- 3′) Sequence (5′- 3′)
ad21 TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT
ad22 ACCGCCCTCCG
AP1 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA
AP2 AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT
SSP1 MGNACNAARCAYATHGA3
SSP2 GCNGAYATYTTYACYAA3
　　3 R = A or G, Y = C or T/U, M = A or C, H = A, C or T/U, N = A, G, C or T/U.
11212　 IRAP分析 　参考 Kalendar 等 (2000) 的方法并进行优化 (杜晓云和罗正荣 , 2006)。210%
琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物。SYNGENE凝胶成像系统观察和记录谱带。
2　结果与分析
211　RNa seH2L TR序列的 PCR扩增及克隆测序
　　抑制 PCR方法利用了一段特殊的接头序列 ,
在链内退火先于链间退火的前提下 , 通过形成锅
柄状结构屏蔽非特异性引物结合位点 , 从而达到
特异性扩增目的片段的富集 ( Siebert et al. ,
1995)。本试验采用 RNaseH酶基因简并引物与接
头引物组合进行抑制 PCR扩增 , 琼脂糖凝胶电泳
检测。结果表明 , 第一次 PCR扩增 (引物组合为
AP1和 SSAP1) 产物在泳道上呈均匀的弥散状分
布 , 范围介于 100～1 000 bp, 说明抑制 PCR达到
很好的抑制效果 (图 1)。进一步巢式 PCR扩增
(引物组合为 AP2和 SSAP2) 并克隆 , 挑选插入
目的片段大于 200 bp 的 38个阳性克隆测序的结
果显示 , 有 36条序列两端为目的引物 , 除去重复
序列 , 共获得 31条序列 , 本试验以 rtdk为前缀命
图 1　抑制 PCR扩增结果
M: DL 2000 marker; 1: 第 1次抑制 PCR扩增结果 ;
2: 巢式 PCR扩增结果。
F ig. 1　Electrophoresis of suppression PCR
M: DL 2000 marker; 1: Electrophoresis of the p rimary supp ression
PCR; 2: Electrophoresis of the nested PCR.
名核苷酸序列。序列已提交 GenBank, 登录号为 EU068698～EU068728。
212　Ty12cop ia类逆转座子 RNa seH 3′端氨基酸序列特性分析
由于 Ty12copia类逆转座子的 LTR为非编码区 , 因此只将其 RNaseH区域翻译为氨基酸 , 并以前
缀 RH rtdk作相应命名 , Ty12copia类逆转座子结构见图 2。在部分序列中虽然氨基酸序列完全相同 ,
但各自的核苷酸序列仍有差异 , 因而作为不同序列进行命名。31条 RH rtdk序列中 , 起始 6个氨基酸
序列完全一致 , 均为 Ty12copia类逆转座子 RNase H 3′末端的保守结构域 AD IFTK, 表明所得序列为
Ty12copia类逆转座子的 RNaseH区。氨基酸总序列间在长度和组成上均表现出高度异质性。序列间相
似性变幅为 1613% ～100% , 距第一个终止密码子出现的长度变化范围是 7～60个氨基酸 , 平均长度
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26个氨基酸 , 表明终止密码子突变可能是造成 RNaseH 3′端氨基酸序列长度多态性的原因之一。在分
析的 31条序列中 , RH rtdk4和 RH rtdk6表现最为明显 , 二者终止密码子紧随 AD IFTK结构域之后 ;
RH rtdk23相对于 RH rtdk24, 在第 17个氨基酸位点发生终止密码子突变。
此外 , 插入或缺失突变也可能造成这些序列长度间的差异。如 RH rtdk16和 RH rtdk22间发生 8个
氨基酸的缺失 , RH rtdk23相对于 RH rtdk24, 在第 25、26位发生 FF两个氨基酸缺失 (图 2)。进一步
分析结果表明 , RH rtdk27、RH rtdk31和 RH rtdk28间明显存在氨基酸残基的点突变 , 其中 , RH rtdk27
发生点突变的位点最多 , 分别位于第 7、14、29和 47位 ; RH rtdk31有两处 , 位于第 25和 43位 ;
RH rtdk28仅有一处 , 在第 46位处 ; RH rtdk23和 RH rtdk24在第 22位发生 D→H的氨基酸改变 , 表明
点突变可能是造成 RNaseH 3′端氨基酸序列长度多态性的原因之一。
图 2　Ty12copia 类逆转座子结构及罗田甜柿 Ty12copia 类逆转座子 RNa seH第二保守结构域、PPT和 L TR关键序列比对
中间括号内的数字表示终止密码子与 PPT间距 , 末尾括号内的数字表示所列 LTR之后省略的核苷酸数。
F ig. 2　The structure of Ty12copia group retrotran sposon and the key short sequences a lignm en t of RNa seH M otif 2,
PPT and L TR sequence of partia l Ty12copia like retrotran sposon s in D iospyros kaki Thunb. ‘L uotian2tian sh i’
Intervening sequences number between stop codon and PPTs was shown in the m iddle brackets,
and the last was the number of om itted nucleotide acid behind the listed LTR.
213　Ty12cop ia类逆转座子 PPT和末端倒转重复序列 ( IR) 特性分析
参考 Galindo等 (2004) 的方法 , 对序列中 PPT及 IR结构选择定位。所获 31条 RNaseH2LTR序
列 RNaseH 3′端的终止密码子和 LTR之间区域 , 均可找到一段由连续的腺嘌呤 (A ) 和鸟嘌呤 ( G)
组成的多聚腺苷酸链 , 但在长度、组成和距离 RNaseH终止密码子的远近上存在很大差异。其中 , 有
7条序列的 PPT位于 RNaseH的终止密码子内部。以 rtdk2p命名各 RNaseH2LTR对应的 PPT序列 , 31
条 RNaseH2LTR序列中 , PPT长度介于 8～13 bp之间 , 最短的为 rtdk2p2、 rtdk2p7和 rtdk2p8, 最长的
为 rtdk2p13, 其中几个 PPT序列中发现有单个嘧啶碱基的插入 (图 2)。统计不同 PPT寡核苷酸链中
A或 G碱基占有的相对比例并作比较后发现 , A 与 G在 PPT中出现的几率有 3种情况 : A比例高
( rtdk2p3, 80% ) , G 比例高 ( rtdk2p10, 7718% ) , A /G 比例相当 ( rtdk2p12, A = 4612% , G =
4612% )。其出现几率分别为 : 13 /31、9 /31、9 /31, 基本无显著差异 , 且 PPT对 A或 G的使用似乎
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不存在明显偏好性。PPT与 RNaseH终止密码子之间距离变化范围介于 ( - 22 bp ) ～100 bp之间 ,
rtdk20和 rtdk24是所有克隆序列中 PPT距 RNaseH终止密码子最远的 2个 , 有 7个序列的 PPT紧随
RNaseH终止密码子之后 , 如图 2所示。末端倒转重复序列 ( IR) 在 Ty12copia类逆转座子作为 3′LTR
起始的标志 , 上述对 PPT区域进行选择鉴定时 , 也参照了该项结构特点。克隆的 31条序列中 , IR起
始两碱基为 “TG”的有 20条 , 其余 11条为 “TA”。“TG/TA”与 PPT的相对位置在序列间表现出微
小差别 , 其中 , 14条 “TG” IR起始碱基和 5条 “TA” IR起始碱基紧随其 PPT之后 , 剩余的 11条序
列则在 IR与 PPT间插入了 1～2个不等的其它碱基 (图 2)。
214　RNa seH2L TR序列的同源性及聚类分析
由 DNA Star510计算 31条 RNaseH2LTR核酸序列间的相似百分比 , 可将序列间的同源性程度数量
化。31条序列相似性比例的变化范围为 410% ～9918% , 平均为 18186% , 差异性最小的为 rtdk13和
rtdk14, rtdk16和 rtdk23的相似性最低。可见同一基因组来源的一类逆转座子也存在高度的异质性。
由 Mega 310软件中的邻接法构建进化树 , 并使用 Bootstrap对各分支的置信度进行评估。进化树
拓扑结构及各分支的置信度如图 3所示。根据进化树的分支程度把 31条序列分为 10个组 , 每个组归
为一个家族。其中 , 家族 Ⅱ、V、V I、 IX分别只有一条序列 , 它们和其它家族间存在较大的遗传距
离。第 I家族中 rtdk28、 rtdk33、 rtdk27、 rtdk32、 rtdk34、 rtdk31、 rtdk26序列间的同源性很高 , 相似
性可达到 9616% ～9917% , 其中 , rtdk26、rtdk32、rtdk33、rtdk34序列间推导的 RNaseH的氨基酸序列
100%相同 , 但核苷酸序列间存在 1～4个碱基替换产生的差异。在其它几个家族中也发现类似现象 ,
如家族 Ⅲ中的 rtdk20和 rtdk24, 家族 IV中 rtdk13、 rtdk21、 rtdk14、 rtdk18和 rtdk19, 家族 Ⅶ中 rtdk15
和 rtdk17, 家族 Ⅷ组的 rtdk2和 rtdk8以及家族 X组中 rtdk3、 rtdk5和 rtdk9。 rtdk20和 rtdk24除了在
RNaseH区发生一处 A→G替换外 , RNaseH终止密码子以外还发现两处碱基替换和 8个连续碱基的缺
失 ; 碱基的取代、缺失或插入在上述提到的其它序列间也较为普遍。可见碱基间取代、缺失或插入突
变可能是同一家族的逆转座子产生多拷贝群的原因之一。
图 3　罗田甜柿 Ty12copia 类逆转座子 RNa seH2L TR序列系统进化树
Bootstrap值大于 50%的被标出。
F ig. 3　Phylogenetic tree of nucleotide ac id sequence of RNa seH2L TR of Ty12copia like retrotran sposon s
in D iospyros kaki Thunb. ‘L uotian2tian sh i’
Bootstrap value over 50% were showed.
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215　 IRAP预分析结果
基于图 3所示的第 I、V、 IV、V I家族的 rtdk11和 rtdk4、 rtdk12、 rtdk14、 rtdk16序列 , 分别设计
了 5条引物 , 依次命名 : rtdk112f、 rtdk42f、 rtdk122f、 rtdk142r、 rtdk162f (以序列名称后附加 “f”或
“r”字母区分引物的正反向 ) , 前两条为 PPT引物 , 后 3条为 LTR引物。5个逆转座子引物在 7份柿
属种质的单引物 IRAP分析中均得到扩增 , 扩增谱带清晰 , 多态性丰富 (图 4) , 表明它们各自代表的
逆转座子家族在柿属植物中普遍存在 , 参试引物具有属的通用性。不同引物扩增片段大小差异较大 ,
如 rtdk112f和 rtdk142r扩增产物集中分布于 750～ > 2 000 bp的大片段区 , 而 rtdk42f和 rtdk122f扩增产
物在 100～ > 2 000 bp均有分布 , 表明逆转座子在柿基因组的拷贝数和相互间排列分布模式表现多型
性。每个引物扩增的谱带数不同 , 如 , 由 rtdk122f、 rtdk42f、 rtdk142r引物产生的谱带分别为 25条、
16条和 15条 , 由 rtdk112f、 rtdk162f分别只有 10条和 12条 , 表明了各引物代表的逆转座子存在转座
活性差异。由 5个引物检测到的 5份栽培柿 ( 1～5号 ) 种内多态性水平分别为 : 91% ( rtdk112f)、
8715% ( rtdk42f)、88% ( rtdk122f)、100% ( rtdk142r) 和 8313% ( rtdk162f) , 表明这些逆转座子参
与了柿种内遗传多样性的分化。除 rtdk142r外 , 其余 4个引物在栽培柿与其近缘种间的扩增谱带形式
无明显差异 , 表明它们对应的逆转座子家族转座活性较强 , 可能目前仍具转座能力。
图 4　5个逆转座子引物在 7份试材中的 IRAP扩增
1: 富有 ; 2: 罗田甜柿 ; 3: 禅寺丸 ; 4: 磨盘柿 ; 5: 平核无 ; 6: 君迁子 ; 7: 老鸦柿。
F ig. 4　 IRAP perform ed on 7 D iospyros spp. by using rtdk112f, rtdk42f, rtdk122f, rtdk142r and rtdk162f
1: Fuyuu; 2: Luotian2tianshi; 3: Zenjimaru; 4: Mopanshi; 5: H iratanenashi; 6: D. lotus L. ; 7: D. rhom bifolia Herosl.
3　讨论
RTKH ID和 AD IFTK为 Ty12copia 类逆转座子 RNaseH基因中两个相当保守的结构域。 Pearce 等
(1999) 首次将它们用于分离豌豆、大豆和挪威云杉的 RNaseH2LTR序列 , 实现从未知基因组信息直
接获取逆转座子 LTR序列信息的技术突破。基于二者结构域的保守性 , RNaseH2LTR序列相继又在豌
豆 ( Pearce et al. , 2000)、甘薯 (Berenyi et al. , 2002)、油棕 ( Price et al. , 2003)、菜豆 ( Galindo
et al. , 2004)、腰果 ( Syed et al. , 2005) 和龙舌兰 (Bousios et al. , 2007) 等植物中得到分离。本
试验采用同源序列法在柿基因组中成功扩增出 RNaseH2LTR 序列 , 结合对 PPT和 IR 结构特征及
RNaseH2LTR的综合分析表明所得结果可靠。
高等植物中的逆转座子以多家族、高拷贝形式存在 , 且高度异质 ( Kumar & Bennetzen, 1999)。
本试验从罗田甜柿中至少获得 10个家族的 Ty12copia型逆转座子 , 不同家族间序列的相似性变异范围
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　4期 杜晓云等 : 罗田甜柿 Ty12copia类逆转座子 RNaseH2LTR序列的分离和特性分析 　
较大 , 最小为 4%。RNaseH 3′端推导的氨基酸序列间及距第一个终止密码子的长度变异较大。除了
同一家族内相似性程度较高的拷贝 , 分离到的 RNaseH2LTR克隆总体表现高异质性。该结果与前人在
豌豆、大豆、挪威云杉和菜豆中的报道 ( Pearce et al. , 1999; Galindo et al. , 2004) 一致。Berenyi
等 (2002) 曾用类似方法克隆甘薯 RNaseH2LTR序列 , 随机挑选的 240个克隆中 , 只有 90个克隆具
有可识别的 RNaseH基因序列 , 而同时具备该基因的终止密码子、PPT及既定的 3′LTR序列结构的克
隆仅有 3个。其结果表明逆转座子 RNaseH2LTR序列变异是一种相当普遍的现象 , 也佐证了本试验得
到的 RNaseH2LTR高度异质的结果。此外 , Nakatsuka等 ( 2002) 对柿属植物反转录酶 (RT, reverse
transcrip tase) 基因部分序列的结构特点进行了探讨。Guo等 (2006) 将基于上述序列的逆转座子分
子标记用于柿属植物 7种 27个基因型的遗传关系分析时 , 结果也表明柿属植物中逆转座子以多拷贝
存在且异质性很高 , 支持本试验的结论。而且 , 本试验最后对部分家族序列 IRAP预分析结果表明 ,
相应的逆转座子家族均表现出丰富的多态性和高丰度的拷贝位点 , 与序列分析所得结论相吻合。
类准种居群序列的存在是逆转座子对不同寄主适应性的表现 , 也是寄主为增强逆境适应性作出的
应激反应的积淀 (Casacuberta et al. , 1997)。本试验获得的 10个逆转座子家族 , 6个家族中都发现
有此类序列存在 , 类似发现在烟草、菜豆等植物中已有过详细报道 (Casacuberta et al. , 1995, 1997;
Galindo et al. , 2004) , 表明此类逆转座子家族目前还具有转座活性 , 可能发生过新近转座整合事件
( Galindo et al. , 2004) , 是将来被重点加以利用以探测柿种下变异的理想候选序列。本试验的其它 4
个家族 (家族 Ⅱ、V、V I、 IX) , 因相互之间以及与其它家族间的关系较远 , 都只含有一条序列 , 表
明这 4个家族相对较 “年轻”, 可能由其它家族成员突变而来或经横向传递后进入柿基因组 , 当然 ,
由于受克隆序列总数的限制 , 也不排除这 4个家族中可能还存在尚未分离的成员。
本试验 IRAP预分析结果表明 , 基于罗田甜柿中分离的 RNaseH2LTR序列开发的逆转座子引物在
其它几个代表不同起源、脱涩类型和倍性的柿品种及其近缘种间都能得到扩增 , 且多态性丰富 , 表明
此类序列用于开发其它逆转座子分子标记并应用到更广泛的柿属种质遗传分析是可行的 ; 本试验中还
看到同样 7份试材 , 不同逆转座子家族的引物表现各异的扩增图谱 , 由此反映的逆转座子转座能力的
差异和在寄主基因组中不同的进化轨迹有助于我们进一步利用这些差异 , 综合考察由不同逆转座子反
馈的寄主进化信息 , 最终绘出更为详尽和准确体现柿种质间进化的谱系图 , 有关工作正在进行中。
本试验首次从罗田甜柿中成功克隆 Ty12copia类逆转座子 RNaseH2LTR序列并证明其具高异质性 ,
IRAP预分析结果表明其在柿属植物中具有丰富的多态性和高丰度的拷贝位点 , 为进一步开发基于
LTR的逆转座子分子标记评价柿的遗传多样性 , 以及为研究其起源、进化途径等提供了依据。
References
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