全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1373～1376
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 02 - 17; 修回日期 : 2006 - 04 - 22
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (2004AA241200) ; 国家 ‘十五’科技攻关计划项目 (2004BA521B02)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: gehong@mail1caas1net1cn)
蝴蝶兰组培中 pH和温度对外植体褐化的影响
赵伶俐 1, 2 　葛　红 13 　范崇辉 2 　印　芳 3 　李秋香 1 　周玉杰 1
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 西北农林科技大学园艺学院 , 陕西杨凌 712100; 3 湖南农业大学
植物激素重点实验室 , 湖南长沙 410128)
摘 　要 : 以蝴蝶兰 R4品种叶片为外植体 , 研究不同 pH培养基、培养温度对褐化率、多酚氧化酶
( PPO) 活性和总酚含量的影响以及褐化率与 PPO、总酚之间的相关性。结果表明 : 培养基 pH 615或培养
温度 20℃时外植体褐化率最低。在相同温度 (25℃) 下 , PPO活性、总酚含量高低并不与 pH值大小成正
比 , 且褐化率与 PPO无显著相关性 , pH 510时 , 褐化率与总酚含量显著相关 ; 在相同 pH (610) 下 , 温度
越高 , 褐化率越高 , PPO活性越强 , 总酚含量越高 , 且 20℃下 , 褐化率与 PPO、总酚含量分别达到极显
著、显著相关 , 30℃下 , 褐化率与总酚含量显著相关。
关键词 : 蝴蝶兰 ; 褐化 ; pH; 温度
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621373204
Effects of pH and Tem pera ture on Brown ing of Pha laenopsis Explan ts
Cultured in V itro
Zhao L ingli1, 2 , Ge Hong13 , Fan Chonghui2 , Yin Fang3 , L i Q iuxiang1 , and Zhou Yujie1
( 1 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Science, B eijing 100081, Ch ina; 2 College of Horticulture,
N orthw est A & F U niversity, Yang ling, Shaanxi 712100, China; 3 Key Labora tory of Phytohorm ones of Hunan A gricultural
U niversity, Changsha, Hunan 410128, Ch ina)
Abstract: The variety‘R4’of Phalaenopsis was used for the study of pH and temperature effect on
polyphenol oxidase ( PPO ) activity, total phenolic content , browning rate of the exp lants, correlation of
browning rate and PPO activity with total phenolic content. The browning rate was the lowest at pH615 or
20℃. Under the same temperature (25℃) , the PPO activity and total phenolic content didnpit have direct ra2
tio with the bulk of pH, and there was no significant correlation between PPO activity and total phenolic con2
tent, but there was significant correlation between browning rate and total phenolic content at pH 510; Under
the same pH (610) , PPO activity, total phenolic content and browning rate increased while the temperature
rose, and there were the best significant correlation between browning rate and PPO activity at 20℃, signifi2
cant correlation between browning rate and total phenolic content at 20℃ and 30℃.
Key words: Phalaenopsis; B rowning; pH; Temperature
1　目的、材料与方法
蝴蝶兰 ( Phalaenopsis) 是兰科蝴蝶兰属多年生常绿附生草本植物 , 为单茎气生兰 , 组织培养是主
要的繁殖方式〔1〕, 但褐化影响其组培苗的成活率。有研究表明褐化主要是由多酚氧化酶 ( PPO) 作用于
天然底物酚类物质形成醌而引起的〔2, 3〕。pH是影响 PPO活性的重要因素 , 不同植物或同属不同种植物
体内 PPO活性的最适 pH均不相同 , 其变化幅度很大〔4～6〕。PPO活性在不同植物中表现的最适温度也不
一致 , 其变化因植物体材料的不同呈现很大差异〔7, 8〕。本试验通过培养基的不同 pH和不同培养温度处
理 , 测定褐化率以及不同时期不同处理中外植体的总酚含量、多酚氧化酶活性 ; 研究褐化率与 PPO活
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
性、总酚的相关性 , 以期通过控制培养基的 pH以及培养温度来降低蝴蝶兰组培的褐化率。
试验材料为中国农业科学院蔬菜花卉研究所的蝴蝶兰 R4品种 (D tp s. King Shiangpis Rose ×Jet2
green Firbird)。培养基均为 MS + 62BA 3 mg·L - 1 , 蔗糖 20% , 琼脂 218 g·L - 1 , 光照强度 2 000～
2 500 lx, 光照时间 12 h /d。pH分别为 510、515、610、615、710, 温度为 (25 ±2) ℃, 常规组培室
中进行 ; 设 20、25和 30℃ 3种温度 ( PQX2300B智能人工气候培养箱中进行 ) , pH 610 ±012。R4植
株叶片 (1 cm ×1 cm) , 每处理接种 20瓶 , 3次重复 , 共 180块外植体 , 用于测定 PPO活性和总酚含
量。另外每处理再接种 30瓶 , 共 90块外植体作为组培中褐化率的观察。
接种后每 3 d观察 1次褐化情况 , 褐化统计以接种外植体边缘以及周围培养基颜色变褐为标准 ,
褐化率 ( % ) =褐化外植体数 /总接种数 ×100%。多酚氧化酶活性的测定参考朱广廉等的方法〔9〕,
略做改进 , 研磨浸提液为 0105 mol·L - 1 pH 518磷酸缓冲液。在 UV21601型分光光度计上测定 525
nm处的 OD值。总酚含量的测定参考 Folin2Denis法〔10〕, 略做改进 , 研磨浸提液为 50%乙醇盐酸
(pH 310) 溶液。500 nm处测定 OD值。采用没食子酸做标准曲线 , 计算总酚含量 , 以 mg·g- 1 FM表
示。试验数据采用 DPS数据处理系统分析。
2　结果与分析
211　不同 pH、温度处理对褐化率的影响
不同 pH与温度引起不同程度的褐化均在接种后第 3天开始发生 , 且褐化率随时间延长而增加。
其中 , pH 510培养的外植体褐化率在整个培养过程中始终处于最高水平 , 到接种第 12天时 , 其褐化
率达到 3212% ; 而 pH 615的褐化最轻 , 仅为 414% (图 1)。可见 , 中性偏酸的培养基对褐化有抑制
作用。pH 510、515、610的 3种培养基中 , 褐化开始时褐色物质就扩散至整个培养基 , pH 615和 710
中则主要集中在外植体边缘褐化且色深 (图版 , 1～5)。在温度处理中 , 接种第 3天时 , 处于 25℃条
件下培养的蝴蝶兰外植体褐化最多 , 为 2313%。在随后的培养过程中 , 褐化率的多少与温度的高低
成正比。到接种第 12天时 , 以 30℃培养的外植体褐化最多 , 达到 70% , 明显高于其他两处理 (图
2)。外植体在 20℃培养的褐化颜色最浅 , 25℃下的褐化较重 , 且培养基的褐化部分主要集中在外植
体切口附近 , 30℃条件下的外植体褐化最严重 , 褐色最深 , 且扩散到整个培养基 (图版 , 6～8)。说
明温度对褐化的影响比较明显 , 温度越高 , 褐化越严重 ; 低温可减轻褐化。
图 1　pH处理对褐化率的影响
F ig. 1　Effect of pH on brown ing ra te of explan t
图 2　温度处理对褐化率的影响
F ig. 2　Effect of tem pera ture on brown ing ra te of explan t
212　不同 pH与温度处理对蝴蝶兰组培外植体多酚氧化酶 ( PPO ) 活性的影响
表 1显示不同 pH导致 PPO活性不同 , 且在不同培养时间变化不一致。刚接种时 , 各处理间 PPO
活性均无明显差异。各处理 PPO活性并不随培养时间延长而绝对增加或减少 , 但均在接种第 3天时
出现上升 , pH 610条件下 PPO活性显著高于 pH 710的 ; 接种第 6天时 , 各处理 PPO活性均有下降 ,
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　6期 赵伶俐等 : 蝴蝶兰组培中 pH和温度对外植体褐化的影响 　
到接种第 12天时又上升 , 其中以 pH 710下的外植体 PPO活性处于最高水平 , 与 pH 515、610的呈显
著差异。不同温度对蝴蝶兰组培外植体中 PPO活性的影响具体表现在两方面 : 同一温度下 , 随培养
时间延长 , 活性趋于增强 ; 温度越高 , PPO活性越大。20℃条件培养的外植体 PPO活性一直低于其
他两个处理。25℃和 30℃下培养的外植体 PPO在接种第 9天时均有 1个下降且 30℃培养的与其他两
个处理的在此时达极显著差异。接种第 12天时 , 以 30℃培养的比 20℃培养的外植体 PPO活性多了
31895个活力单位 , 呈极显著差异。
表 1　不同 pH与温度对蝴蝶兰外植体中 PPO活性的影响
　　　　Table 1　Effect of d ifferen t pH and tem pera ture on activ ity of PPO of Pha laenopsis explan t (△A /0101·m in - 1 ·g - 1 FM)
处理 Treatment
接种天数 Inoculation time ( d)
0 3 6 9 12
pH 510 61000aA 91250abA 51083cC 81000aA 91500abAB
　 515 61167aA 91917abA 61167bcBC 61750abA 81333bB
　 610 61250aA 101500aA 91000aA 71250abA 81417bB
　 615 61833aA 101000abA 61833bABC 51333bB 91750aAB
　 710 61417aA 81583bA 71667abAB 51917abA 101417aA
　 20℃ 41588aA 61729aA 71500bB 81158bB 91563bB
　 25℃ 41708aA 61825aA 111425aA 81096bB 111454abAB
　 30℃ 41479aA 71388aA 111175aA 91130aA 131458aA
　　注 : 邓肯氏显著性检验 , 不同的大、小写字母分别表示在 P = 0101、0105水平上存在显著差异。
Note: Duncanpis multip le test, different cap ital and small letters indicate the significance at level of 0101 and 0105.
213　不同 pH与温度对蝴蝶兰组培外植体总酚含量的影响
不同 pH引起蝴蝶兰外植体体内总酚含量在各测定时期变化不一致 , pH 515时总酚含量最低。各
处理在接种第 3天和第 9天时均有下降 , 整个接种培养过程结束时 (12 d) , pH 510条件下培养的外
植体总酚含量增加了 551796 mg·g- 1 , 处于最高水平 , 与 pH 515、615、710条件下的呈显著差异
(图 3)。在 20℃和 30℃下培养的外植体 , 其总酚含量随培养时间的延长而增加 , 25℃下培养的外植
体总酚含量在接种后的第 6天有下降 , 随后缓慢上升。刚接种时 , 三处理的总酚含量之间无显著差
异 , 从接种第 6天开始到整个培养结束时 (12 d) , 30℃下培养的外植体总酚含量均与其他两处理呈
显著差异 (图 4)。
图 3　不同 pH对外植体总酚含量的影响
F ig. 3　Effect of d ifferen t pH on tota l phenolic con ten t of explan t
图 4　不同温度对外植体总酚含量的影响
F ig. 4　Effect of d ifferen t tem pera ture on tota l phenolic
con ten t of explan t
214　褐化率与 PPO活性、总酚含量之间的关系
从表 2可看出 , pH各处理中 , PPO活性与褐化率均不存在显著相关性 , 这说明在不同 pH处理
的蝴蝶兰组织培养中 , PPO活性可能不是引起其褐化的主要因素 , 可能是由于切割导致膜完整性被破
坏或者其他氧化酶作用 , 从而引起褐化 , 这还需进一步的验证。20℃下外植体褐化率与 PPO活性存
在极显著相关 , 表明 20℃下 , 随培养时间延长 , PPO活性增强是引起褐化率增高的因素。在 pH 510、
20℃、30℃处理下 , 褐化率与总酚达到显著相关水平 , 表明在这些条件下 , 随培养时间延长 , 褐化率
增高是与总酚含量增加有关的。
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表 2　不同处理中褐化率与 PPO活性、总酚含量之间的相关系数
Table 2　Correla tion m odulus of brown ing ra te and PPO activ ity w ith tota l phenolic con ten t of d ifferen t trea tm en t
处理 Treatment pH 510 pH 515 pH 610 pH 615 pH 710 20℃ 25℃ 30℃
PPO 01549 01258 01128 01506 01464 019793 3 01779 01861
总酚 Phenolic content 019093 01724 01867 01764 01504 019373 01785 019363
　　3 3 为 1%显著性水平 ; 3 为 5%显著性水平。3 3 indicate significant level at 1% ; 3 indicate significant level at 5%.
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