全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (3) : 518～522
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 07 - 29; 修回日期 : 2006 - 01 - 06
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30371001)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: tjying@hzcnc1com)
番茄乙烯受体基因反义表达对果实成熟的影响
王中凤 1, 2 　应铁进 13 　张　英 2 　鲍碧丽 1 　黄晓丹 1
(1 浙江大学食品科学与营养系 , 浙江杭州 310029; 2 广西工学院生物与化学工程系 , 广西柳州 545006)
摘 　要 : 以乙烯受体基因 LeETR1和 LeETR2的转反义基因株系 ale1和 a le2为材料 , 对果实成熟特性进
行了研究。转基因番茄果实与对照相比 , 呼吸速率下降 , 但乙烯释放速率增加 1～4倍 , 呼吸高峰和乙烯跃
变高峰出现的时间没有改变 , 表明果实成熟起始时间没有改变。a le1果实成熟后期着色速度减慢 , 红熟果
色泽 a值、番茄红素和类胡萝卜素含量都显著低于对照 ; 但果实多聚半乳糖醛酸酶活性上升和硬度下降速
度都显著高于对照。这说明 LeETR1基因与果实成熟品质特征的形成可能存在比较复杂的关系。
关键词 : 番茄 ; 乙烯受体基因 ; 果实成熟
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320518205
Effect of Ethylene Receptor Genes An tisen se Tran sforma tion on Fru it
R ipen ing
W ang Zhongfeng1, 2 , Ying Tiejin13 , Zhang Ying2 , Bao B ili1 , and Huang Xiaodan1
(1D epartm ent of Food Science and N utrition, Zhejiang U niversity, Hangzhou, Zhejiang 310029, China; 2D epartm ent of B iologi2
ca l and Chem ical Engineering, Guangxi Institu te of Technology, L iuzhou, Guangxi 545006, China)
Abstract: Fruit ripening characteristics of antisense transgenic lines a le1 and a le2 respectively from eth2
ylene recep tor genes L eETR1 and L eETR2 were studied. Compared to the wild type, transgenic lines disp layed
that resp iration rate decreased, whereas ethylene p roduction increased 1 - 4 folds, which suggest that starting
time of fruit ripening were not affected. A t later stage of a le1 fruit ripening, a2value, carotenoid and lycopene
contents was lower than that in wild type fruit. A lthough the speed of fruit coloring slow down in a le1, the po2
lygalacturonase increasing and firmness decreasing were sped up. The results suggest that there is some intri2
cate relation between L eETR1 and fruit ripening.
Key words: Tomato; Ethylene recep tor gene; Fruit ripening
番茄属于跃变型果实 , 果实的成熟受乙烯调控。乙烯对果实成熟的调控从乙烯合成开始 , 经过乙
烯信号转导 , 诱导成熟相关基因表达 , 各种成熟品质特性形成。在这个过程中任一环节发生改变都可
能影响果实成熟或者某些成熟特性的改变。ACC合成酶〔1〕和 ACC氧化酶〔2〕在番茄中的反义表达抑制
内源乙烯合成 , 从而使果实成熟软化明显延迟。
已经发现的番茄乙烯受体基因家族有 6个成员 , 即 L eETR1～L eETR6, 其中 L eETR3 (N R ) ～
L eETR6的表达水平受发育调控〔3〕。N R和 L eETR4受果实成熟的调控 , 随果实成熟表达量增加 , 降低
NR表达水平对乙烯信号转导和果实成熟没有明显效果 , 但使 L eETR4 mRNA水平升高 , 表明 L eETR4
可能在转录水平上对 N R有补充作用 〔3〕。降低 L eETR4表达水平产生超敏感乙烯反应表现型 , 加速果
实成熟 , 提示 L eETR4在果实成熟过程中起重要作用〔3〕。NR基因第 411位碱基 C突变成 T, 导致其编
码的蛋白质第 36号氨基酸由脯氨酸变成了亮氨酸 , N r突变体则表现强烈乙烯不敏感性 , 果实不能正
常成熟〔4〕。在 N r突变体中反义表达 N r基因则使果实成熟恢复正常。说明 N R基因并不是果实正常成
熟所必须 , 从而也证实了乙烯信号转导的受体抑制模型〔5〕。在拟南芥乙烯受体家族中 , 仅有 ETR1功
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　3期 王中凤等 : 番茄乙烯受体基因反义表达对果实成熟的影响 　
能缺失突变产生明显增强的乙烯反应 , 其它受体单一缺失突变体没有如此反应〔6〕, 提示 ETR1在拟南
芥乙烯受体家族中可能具有特别重要的功能地位。对拟南芥乙烯受体的研究主要针对营养器官或组织
的乙烯反应 , 由于材料的特殊性 , 不利于研究其在果实成熟方面的调控作用。L eETR1和 L eETR2与拟
南芥 ETR1具有高度同源性 , 在番茄中各发育时期和各组织中组成性表达 , 不随果实发育而改变表达
丰度〔7〕。降低了 L eETR1表达水平的反义株系表现节间缩短 , 推迟脱落等性状 , 未见在果实成熟性状
上有明显变化〔8〕。为了进一步探索 L eETR1 和 L eETR2 与果实成熟的关系 , 本研究对 L eETR1 和
L eETR2基因进行了反义表达 , 对所获得的反义表达株系 a le1和 a le2果实成熟过程色泽、硬度及其相
关的生物化学特性进行了分析。
1　材料与方法
以大棚内春季种植的 a le1 (L eETR1反义表达株系 )、a le2 (L eETR2反义表达株系 ) 和 B1 (野生
型对照株系 ) 为材料。果实成熟期间 , 采集相应成熟期果实进行如下各项测定。
111　果实呼吸速率和乙烯释放速率的测定
采摘绿熟期果实室温下自然贮藏 , 定期检测 CO2释放量。参照薛应龙〔9〕的方法 , 取 5～8个 (质
量 500～1 000 g) 果实 , 放入真空干燥器中 , 在一个平皿中加入 014mol·L - 1 NaOH 20 mL, 并将平皿
置于果实之上 , 密封 1 h。取 1 mL顶隙空气检测乙烯浓度。取出平皿 , 参照薛应龙〔9〕的方法测定平
皿吸收的 CO2 量。采收当天标记为第 0天 , 之后每 2 d检测 1次。重复 3次。
乙烯测定 : 采用 SP - 6 800A (山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司 ) 气相色谱仪 , 氧化铝柱 , 检测
室温度 120℃, 柱温 80℃〔10〕。
112　果实色泽的测定
参照 Klee〔10〕的方法 , 采用 W SC - S测色色差计 (上海精密科学仪器有限公司 ) , 采用 L、 a、b色
泽系统 , 测定色泽 a值 , 每个果实沿赤道测定 4个对称点 , 每株系测定 10个果实 , 取其平均值。
113　色素含量的测定
分别采收各株系绿熟期、转色期、红熟初期和红熟期的果实 , 参照 B rown等〔11〕、Adsule等〔12〕、
Sandmann〔13〕的方法 , 以己烷∶丙酮 (60∶40) 混合溶剂提取果实组织混合样品中的色素 , 于可见分光
光度计读取 OD450、OD502、OD645和 OD663值 , 以空白溶剂作对照。015 g样品在液氮中研磨成粉 , 转入
10 mL离心管中 , 加 3 mL已烷 ∶丙酮 (60∶40) 混合液充分振荡 , 静置片刻 , 将上部有机相转入另一
试管。重复该步骤 2次 , 合并 3次有机相 , 定量提取液体积 , 充分混匀 , 用于测定。计算各种色素含
量 : 叶绿素 (μg·g- 1 ) = (2012 ×OD645 + 812 ×OD663 ) ×样液体积 /样品质量 ; 类胡萝卜素 (μg·
g- 1 ) = 4 ×OD450 ×样液体积 /样品质量 ; 番茄红素 (μg·g- 1 ) = 3112 ×OD502 ×样液体积 /样品质量。
114　多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶活性的测定
参照周培根等〔14〕的方法 , 提取各成熟期果实粗酶液。参照李忠福等〔15〕的方法 , 吸取 2 mL粗酶
液与 2 mL 014%果胶溶液混合 , 在 45℃恒温水浴中反应 30 m in, 然后加入 115 mL DNS试剂进行显色
反应 , 测定 OD520 , 计算多聚半乳糖醛酸酶活性活力。
取 2 mL粗酶液调 pH 710, 加入 5 mL pH 710的果胶溶液中 , 加两滴中性红指示剂 , 摇匀 , 定时
30 m in,待溶液显示红色用 0105 mol·L - 1 NaOH滴定至红色消失 , 如此重复操作 30 m in, 记录消耗的
NaOH总体积 , 计算果胶酯酶活力 [ 9 ]。
115　果实硬度的测定
参照 Jackman等〔16〕的方法 , 从田间采集转色面积小于 10%的果实 , 室温 ( 24～28℃) 自然贮
存。以 TAXT2 i质构仪 (UK) 测定 , 每果测顶点、赤道上对称 4点 , 共 5个点 , 每点取果皮约 1
cm
2
, 表皮向下 , 以直径 5 mm柱形探头测定刺破 1 mm果皮时探头所移动的距离和消耗的力。结
果表示为N·m in - 1。
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2　结果与分析
211　呼吸速率和乙烯释放速率
转基因株系和野生型株系采摘当天呼吸速率都较高 (图 1) , 这可能是由于田间生长状态代谢活
跃 , 采收伤害刺激下 , 造成短时呼吸代谢紊乱所致。采后从较高的呼吸速率迅速下降 , 采收 4 d后又
开始上升。反义株系 a le1和 a le2高峰值比对照 B1略有下降 ( P≤0105) , 采后呼吸速率的变化幅度
也比对照小 , 这提示乙烯受体 L eETR1和 L eETR2可能与果实的呼吸代谢有某种关系 , 或者基因转移
过程可能对呼吸系统产生了某种伤害。
与呼吸速率相反 , 绿熟期采收的果实乙烯释放速率很低 , 2 d后转基因株系检查到极低浓度乙
烯 , 0157μL·h - 1 ·kg- 1 , 随后才开始稳定上升 , 均在采后 6天出现乙烯释放速率合成高峰 , 株系间
乙烯释放速率峰值差异显著 ( P≤0101, 图 2)。其中 a le2是 B1的 5倍左右 , a le1接近 B1的 3倍。对
照株系果实乙烯释放速率远远低于转基因株系。乙烯受体通过结合乙烯传递乙烯信号 , 受体数量越
少 , 乙烯被结合的数量减少 , 检测到的乙烯释放速率可能有所提高。另一方面也提示反义 L eETR1和
L eETR2基因转入可能对果实乙烯合成系统产生了影响 , 导致乙烯产量增加。
乙烯对果实成熟的启动必须在生理成熟基础上 , 不能启动未达到生理成熟期的果实后熟。尽管在
高峰期各株系间乙烯释放速率差异显著 , 但乙烯高峰和呼吸高峰到来的时间却是一致的 , 说明反义乙
烯受体基因 L eETR1和 L eETR2的表达没有改变果实成熟的起始时间 , 或者 L eETR1和 L eETR2对果实
膨大生长阶段没有直接的调控作用。
212　果实成熟过程中色泽和色素含量的变化
绿熟期果实在室温下自然成熟 , 各株系从采
摘到转色起始的时间相同 , 这与呼吸高峰和乙烯
跃变高峰没有改变的结果一致 , 进一步说明了
L eETR1和 L eETR2对果实膨大生长阶段没有直接
的调控作用。转色后转基因果实色泽 a值上升比
对照缓慢 , a le1着色速度比 a le2更慢 ( P≤0105)
(图 3)。
随着果实成熟度提高 , 番茄红素和类胡萝卜
素含量都呈快速上升趋势。转基因果实番茄红素
(图 4, A) 和类胡萝卜素 (图 4, B ) 在果实红
熟前变化趋势与对照没有明显差异 , 红熟后期增
图 3　果实成熟过程中色泽 a值的变化趋势
F ig. 3　The a2va lue of fru it dur ing r ipen ing
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加缓慢 , 在红熟果中的含量显著低于对照果实 ( P≤0101)。
213　果实成熟过程中硬度及其相关酶活性的变化
绿熟期多聚半乳糖醛酸酶活性 ( PG) 较低 , 株系间无显著差异。随着成熟度提高各株系 PG升
高 , 其中 a le2和 B1增加缓慢 , a le1增加速度明显更快。到红熟期 a le1 PG比 B1高 58% ( P≤0101)
(图 5, A)。果胶酯酶活性 ( PE) 增加更缓慢 , 株系间差异不显著 (图 5, B )。这表明 L eETR1反义
表达也增强了多聚半乳糖醛酸酶活性 , 但对果胶酯酶活性没有影响。
　　随着果实成熟到一定阶段 , 果肉组织迅速软
化 , 果实货架期和品质都会迅速下降。转色初期
采收的果实硬度较高 , 采后都呈一致的下降趋势 ,
株系间差异不大。采收 12 d后果实充分红熟 ,
a le1采后硬度下降最快 , 处于最低硬度水平 , 与
对照果实差异显著 ( P≤0101, 图 6) , 表示乙烯
受体 L eETR1可能对调控果实硬度变化起着一定
作用。
a le1果胶酶活性上升可能是果实硬度快速下
降的重要原因。
图 6　采后果实硬度的变化
F ig. 6　The f irmness of fru it dur ing r ipen ing
3　讨论
呼吸跃变是跃变型果实成熟和衰老起始的重要特征 , 色泽和硬度的变化是果实成熟的主要品质指
标 , 硬度是决定果实货架寿命的关键因素。转基因株系 a le1和 a le2与对照株系 B1比较 , 呼吸跃变既
没有提前也没有峰值的提高 ; 尽管乙烯释放速率增加数倍 , 乙烯高峰到达的时间没有改变。这说明反
义基因表达并没有改变果实成熟起始时间。但是 , 转基因株系乙烯产量成数倍增加 , 而呼吸高峰却有
所下降 , 说明乙烯跃变与呼吸速率没有直接的因果关系 , 它们分别由不同的代谢系统所调控。
根据负调控模型原理 , 乙烯受体功能缺失可能导致乙烯反应增强 , 相应地果实成熟可能提前或者
加速。但自然状态后熟的 a le1果实颜色转变速度比对照株系 B1慢 , 提示乙烯受体基因 L eETR1与果
实色素合成系统有一定关系 , 但并不符合乙烯受体作用的负调控模型。Tieman等〔3〕对 L eETR4和 N R
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都进行了反义抑制研究 , 反义 L eETR4果实着色速度显著加快 , 反义 N R果实则推迟着色或者着色特
性没有改变。说明乙烯受体家族各成员对果实成熟色素合成的调控各具分工 , 其中的机理相对复杂 ,
还有待深入研究。从果实成熟的另一主要特征硬度下降来看 , a le1果实硬度下降 , 并且多聚半乳糖醛
酸酶活性上升速度加快 , 说明 L eETR1对果实成熟过程硬度变化有负调控作用。L eETR1超表达可能推
迟果实成熟、延长采后寿命 , 这是值得进一步研究的课题。
参考文献 :
1　Oeller P W , Lu M W , Taylor L P, Pike D A. Theologis a reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNA. Science, 1991,
18, 254 (5030) : 437～439
2　Picton S B. A ltered fruit ripening and leaf senescence in tomatoes exp ressing an antisense ethylene2form ing enzyme transgene. Plant J. ,
1993, 3: 469～481
3　Tieman D M, TaylorM G, Ciard I J A, Klee H J. The tomato ethylene recep tors NR and LeETR4 are negative regulators of ethylene response
and exibit functional compensation within a multigene fam ily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 5663～5668
4　Lanahan M B, Yen H C, Giovannoni J J, Klee H J. The never ripe mutation blocks ethylene percep tion in tomato. Plant Cell, 1994, 6: 521
～530
5　Hackett R M, Ho C W , L in Z F, Foote H C C, Fray R G, Grierson D. Antisense inhibition of the N r gene restores normal ripening to the to2
mato never2ripe mutant, consistent with the ethylene recep tor2inhibition model. Plant Physiology, 2000, 124: 1079～1085
6　Hua J, Meyerowitz E M. Ethylene responses are negatively regulated by a recep tor gene fam ily in A rabisopsis tha liana. Cell, 1998, 94: 261
～271
7　Zhou D, Kalaitzis P, Mattoo A K, TuckerM L. The mRNA for an ETR1 homologue in tomato is constitutively exp ressed in vegetative and re2
p roductive tissues. PlantMolec. B iol. , 1996, 30: 1331～1338
8　W hitelaw C A, Lyssenko N N, Chen L, Zhou D, Mattoo A K, TuckerM L. Delayed abscission and internodes correlate with a reduction in
the ethylene recep tor LeETR1 transcrip t in transgenic tomato. Plant Physiol. , 2002, 128: 978～987
9　薛应龙. 植物生理学实验手册. 上海 : 上海科学技术出版社 , 1983. 129～131
Xue Y L. Plant physiological experiment handbood. Shanghai: Shanghai Science and Technique Publishing Company, 1983. 129～131 ( in
Chinese)
10　Klee H J. R ipening physiology of fruit from transgenic tomato (Lycopersicon esculentum ) p lants with reduced ethylene synthesis. Plant Physi2
ol. , 1993, 102: 911～916
11　B rown J M A, D romgoole F I, Guest P M. The effects of spectrophotometer characteristics on the measurement of chlorophylls. Aquat. Bot. ,
1980, 9: 173～178
12　Adsule P G, Dan A. Simp lified extraction p rocedure in the rap id spectrophotometric method for lycopene estimation in tomato. J. Food Sci.
Technol. , 1979, 16: 216～216
13　Sandmann G. Carotenoid biosynthesis in m icroorganism s and p lants. Eur. J. B iochem. , 1994, 223: 7～24
14　周培根 , 罗祖友 , 戚晓玉 , 吴邦良. 桃成熟期间果实软化与果胶及有关酶的关系. 南京农业大学学报 , 1991, 14 (2) : 33～37
Zhou P G, Luo Z Y, Q i X Y, W u B L. The ralationship between fruit softening and changes in pectin and relative enzymes during ripening
of peaches. Journal of Nanjing Agricultural University, 1991, 14 (2) : 33～37 ( in Chinese)
15　李忠福 , 徐建国. 分光光度法测定果胶酶活性方法的研究. 黑龙江医药 , 2002, 15 (6) : 428～430
L i Z F, Xu J G. Determ ination of pectinase activity by spectrophotometry. HeilongjiangMedical Jouranl, 2002, 15 (6) : 428～430 ( in Chi2
nese)
16　Jackman R L, Marangoni A G, Stanley D W. Measurement of tomato fruit firmness. HortScience, 1990, 25 (7) : 781～783
225