全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 1019 - 1022
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 15; 修回日期 : 2007 - 05 - 08
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (20060110Z1072) ; 国家自然科学基金项目 (30671414)3 E2mail: fenghuiaaa@2631net; Tel: 024288487143
羽衣甘蓝游离小孢子培养技术研究及应用
冯　辉 13 , 姜凤英 1, 2 , 冯建云 1 , 王超楠 1
(1 沈阳农业大学园艺学院 , 沈阳 110161; 2 辽宁省农业科学院花卉研究所 , 沈阳 110161)
摘 　要 : 以 10个羽衣甘蓝杂交种为试材进行游离小孢子培养 , 研究胚状体发生和小孢子胚成苗的影响
因素 , 以及小孢子植株倍性鉴定和单倍体加倍方法。结果表明 , 盛花期为最佳取样时期 ; 培养基中 13%的
蔗糖较为适宜 ; 继代培养以 MS + 62BA 2 mg·L - 1 + NAA 011 mg·L - 1为宜 , 平均增殖系数为 5106; 小孢子
再生植株成活率 7416% ; 小孢子植株自然加倍率为 23133% ～37150% ; 单倍体试管苗的加倍处理以秋水仙
素浓度 70 mg·L - 1 , 处理时间 9～11 d为宜 , 加倍率达 54155%。
关键词 : 羽衣甘蓝 ; 小孢子培养 ; 加倍单倍体
中图分类号 : S 635　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0421019204
Establishm en t and Applica tion of the System for Isola ted M icrospore Culture
in Ka le ( B rassica o le racea L. var. acepha la DC. )
FENG Hui13 , J IANG Feng2ying1, 2 , FENG J ian2yun1 , and WANG Chao2nan1
(1 College of Horticulture, Shenyang A gricu ltura l U niversity, Shenyang 110161, China; 2 F loricu lture Institu te of L iaon ing A cade2
m y of A gricultural Science, Shenyang 110161, China)
Abstract: Isolated m icrospore culture was carried out by ten hybrids of kale (B rassica oleracea L. var.
acepha la DC. ). The frequency of embryogenesis, embryos germ inated p lantlets, p loidy identification of m i2
crospores2derived p lantlets and chromosome doubling techniques for hap loid p lantletswere studied. The results
showed that the buds in flourishing florescence were the best for the purpose of m icrospore culture. The su2
crose content of 13% was op timal in medium. MS + 62BA 2 mg·L - 1 + NAA 011 mg·L - 1 was op timalmedi2
um for subculture and the average p ropagation quotiet reached 5106. The survival rate of m icrospore2derived
p lantlets reached 7416%. The DH p lants rate of spontaneous was in the range of 23133% - 37150%. The
treatment of 70 mg·L - 1 colchicine for 9 - 11 d was op timal for hap loid seedlings and led to 54155% doubled
hap loid p lantlets.
Key words: Kale; B rassica oleracea L. var. acepha la DC. ; M icrospore culture; Doubled hap loid
自 L itcher (1989) 首次进行羽衣甘蓝 (B rassica oleracea L. var. acepha la DC. ) 小孢子培养以来 ,
其培养体系仍停留在诱导胚状体发生和获得再生植株阶段 (Duijs et al. , 1992; 汤清林 等 , 2000;
姜凤英和冯辉 , 2005) , 加倍单倍体 (DH) 迄今还未见有报道。作者以引自日本的 10个优良羽衣甘
蓝 F1代杂种为试材 , 通过游离小孢子培养体系的优化 , 首次获得了加倍单倍体植株 , 为选育羽衣甘
蓝新品种奠定了基础。
1　材料与方法
10个引自日本的羽衣甘蓝 F1代杂交种 : ‘红鸠 ’, ‘白鸠 ’, ‘红欧 ’, ‘白欧 ’, ‘青汁 ‘ ψ Ë ’,
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
‘圆叶红心’, ‘圆叶白心 ’, ‘皱叶红心 ’, ‘皱叶白心 ’和 ‘皱叶玫红 ’。7月中旬穴盘育苗 , 8月中
下旬分盆 , 11月移到温室进行长光照处理 , 花期取材。
花期选取处于单核晚期和双核早期的羽衣甘蓝花蕾 (长度 310～415 mm ) , 用于分离、纯化小孢
子。纯化后用 NLN213培养液稀释密度至 1～2 ×105 ·mL - 1 , 以每皿 215 mL小孢子悬浮液分装入直径
60 mm的培养皿内 , 石蜡膜封口 , 先在 33℃恒温箱中热激处理 1 d, 再转至 25℃下静置暗培养。2～3
周后观察胚状体发生情况。
将子叶形胚状体转入 MS固体成苗培养基中 , 以琼脂浓度调节培养基中水分含量 , 蔗糖浓度为
3% , pH 518, 在光照培养室中培养 , 30 d继代 1次。
将在成苗培养基上长成幼苗的再生小植株 , 于无菌条件下去除大叶片 , 取长 2～3 cm的顶芽或腋
芽部分 , 移入 MS固体培养基上 , 添加不同浓度配比的 62BA 和 NAA, 蔗糖 3% , 琼脂 018% , pH
518, 25℃光照培养 , 30 d后统计增殖情况。经多次继代培养后获得一定数量的试管苗 , 经生根诱导
后 , 移栽成活即获得小孢子再生植株。
采用根尖细胞有丝分裂染色体计数及花粉母细胞减数分裂染色体计数 , 对再生植株进行倍性鉴
定。将单倍体试管苗转接在添加不同浓度秋水仙素的 MS固体培养基上 , 继续培养 5～9 d进行加倍处
理 , 以提高加倍单倍体植株获得率。
2　结果与分析
211　基因型及培养条件对小孢子胚诱导的影响
在 NLN213基本培养基上 , 小孢子经培养 2～3周后 , ‘红欧 ’、‘圆叶红心 ’、‘圆叶白心 ’、‘皱
叶红心 ’和 ‘皱叶白心 ’5个品种获得了胚状体 , 占供试材料的 50%。其中 ‘圆叶红心 ’胚状体诱
导率最高 , 达 0173胚 ·蕾 - 1 ; ‘红欧 ’胚诱导率最低 , 只有 0110胚 ·蕾 - 1。方差分析结果表明 , 不
同基因型材料之间小孢子胚诱导率存在显著差异。取样时期以盛花期最佳 , 初花期次之 , 末花期取样
没有获得胚状体。培养基蔗糖浓度试验结果表明 , 13%的蔗糖浓度较为适宜 , 16%的蔗糖浓度次之 ,
10%的蔗糖浓度不适宜羽衣甘蓝小孢子培养。
212　胚状体的发育
同一皿中胚状体的发育是不同步的 , 有子叶形胚、鱼雷形胚、心形胚、球形胚、畸形胚和萌发
胚。在成苗培养基上 , 部分萌发胚、子叶形胚与种子萌发一样 , 子叶转绿 , 胚根伸长 , 胚轴也很快伸
长 , 进一步发育成具有真叶的小植株。鱼雷形胚有两条成苗途径 : 一是胚根伸长 , 子叶萌发 , 与子叶
形胚状体成苗相似 ; 另一种是经脱分化后 , 形成绿白致密的愈伤组织 , 再分化成幼苗。另有部分萌发
胚、子叶形胚和鱼雷形胚胚根伸长 , 但胚芽不生长而是发生褐化 , 得不到小植株。心形胚和球形胚转
接后 , 大部分胚状体颜色变褐而死亡 , 少部分能分化成苗。
213　试管苗的继代培养
以 ‘皱叶红心 ’试管苗为材料 , 筛选羽衣甘
蓝继代培养的适宜培养基 , 结果见表 1。在不加
植物生长调节剂的培养基中 , 顶 (腋 ) 芽只有其
本身的芽形成小植株 , 均未有幼芽的分化 ; 在添
加少量植物生长调节剂的培养基中 , 增殖系数不
高 , 达到 3100左右 ; 而当细胞分裂素浓度与生长
素的比例适宜时 , 增殖系数达到 5100左右 , 最高
可达 6113。对各培养基的平均增殖系数进行邓肯 表 1　 62BA和 NAA对羽衣甘蓝继代增殖的影响Table 1　Effects of 62BA and NAA on propaga tion of ka le62BA(mg·L - 1 ) NAA(mg·L - 1 )平均增殖系数Average p ropagationfrequency 分化情况D ifferentiationsituation0 0 1100fF 无幼芽分化No sp rout differentiation2 0 2184eE 丛状 Bush form2 0102 3112dD 丛状 Bush form2 0105 4147cC 丛状 Bush form2 0110 5106bB 丛状 Bush form
2 0120 6113aA 聚丛状 Poly2bush form
0201
　4期 冯 　辉等 : 羽衣甘蓝游离小孢子培养技术研究及应用 　
氏新复极差测验 , 不同处理之间存在极显著差异 , 62BA 2 mg·L - 1 +NAA 012 mg·L - 1虽然增殖率最
高 , 但丛生芽苗长势细弱 , 呈聚丛状 , 不利于壮苗培养。羽衣甘蓝继代适宜培养基为 MS + 62BA 2
mg·L - 1 + NAA 011 mg·L - 1 , 平均增殖系数为 5106。
214　试管苗的移栽
4个品种小孢子植株移栽成活情况见表 2。各
品种小孢子植株移栽成活率有一定差异。‘皱叶
红心 ’和 ‘圆叶红心 ’的成活率较高 , 分别达
7819% 和 7510% ; ‘红欧 ’的移栽成活率最低 ,
仅为 6617%。
215　染色体自然加倍
通过植株形态观察和花粉母细胞染色体计数 ,
对 67个小孢子植株倍性进行了鉴定 , 结果见表 3。
表 2　基因型对小孢子植株移栽成活的影响
Table 2　Effect of genotypes on the surv iva l ra te of
m icrospore2der ived plan tlets in ka le
品种
Variety
移栽株数
Number of trans2
p lanted p lantlets
成活株数
Number of
survival p lantlets
成活率
Survival
rate ( % )
红欧 Hongpiou 　9 　6 6617
圆叶红心 Yuanyehongxin 32 24 7510
皱叶红心 Zhouyehongxin 147 116 7819
皱叶白心 Zhouyebaixin 10 　7 7010
供试的 4个品种的小孢子植株倍性差别较大。6个 ‘红欧 ’的小孢子植株均为单倍体 ; 7个 ‘皱叶白
心’的小孢子植株均为加倍单倍体 ; ‘皱叶红心’和 ‘圆叶红心’的小孢子植株有多种倍性植株出现。
表 3　小孢子植株的倍性分布
Table 3　Spon taneous plo idy induction of the m icrospore2der ived plan ts in ka le
品种
Variety
鉴定植株
Plants
单倍体
Hap loid
p lants
加倍单倍体
DH
p lants
高倍体
Polyp loid
p lants
嵌合体
Chimeric
p lants
自然二倍化率
Rate of spontaneous
dip loidization ( % )
红欧 Hongpiou 6 6 0 0 0 　0100
圆叶红心 Yuanyehongxin 24 6 9 2 1 37150
皱叶红心 Zhouyehongxin 30 17 7 4 2 23133
皱叶白心 Zhouyebaixin 7 0 7 0 0 100100
由表 4可知 , 秋水仙素浓度为 100 mg·L - 1时对试管苗的毒害作用较大 , 处理 5 d的试管苗死亡
率已达到 45145% , 处理 11 d试管苗全部死亡。秋水仙素浓度为 70 mg·L - 1 , 处理时间为 9 d较为适
宜 , 加倍率达到 54155 % ; 其次为 70 mg·L - 1 , 处理 11 d, 加倍率 44144 %。
表 4　秋水仙素浓度和处理时间对单倍体加倍的影响
Table 4　Effect of colch ic ine concen tra tion and dura tion on plo idy induction of haplo id plan tlets
秋水仙素 Colchicine
处理浓度
Concentration (mg·L - 1 )
处理时间
Duration ( d)
处理苗数
Number of
treated p lantlets
幼苗死亡率
Death rate of
p lantlets( % )
染色体加倍频率
Efficiency of chromosome
doubling( % )
　0 0 15 13133 15138
40 5 12 16167 20100
40 7 16 18175 23108
40 9 13 23108 30100
40 11 8 25100 33133
70 5 11 18118 22122
70 7 14 21143 36136
70 9 15 26167 54155
70 11 13 30177 44144
100 5 11 45145 33133
100 7 11 63164 50100
100 9 11 81182 50100
100 11 12 100100 -
1201
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
3　讨论
基因型对甘蓝类植物小孢子胚状体的发生有较大影响。张德双等 (1998) 在 13个绿菜花供试材
料中发现只有 8种基因型有胚胎发生 , 并获得了 5种基因型再生植株。本试验以 10个羽衣甘蓝品种
为材料 , 有 5个基因型的胚状体诱导获得成功 , 并获得 4种基因型再生植株。可见 , 并不是所有的基
因型都可以通过游离小孢子培养的方法获得小孢子胚。
小孢子植株移栽成活能力与植株的倍性有关。单倍体幼苗由于长势较弱 , 移栽不易成活 ; 多倍体
和嵌合体植株发育不良 , 移栽成活率也较低。
在甘蓝型油菜小孢子培养初期 , 用添加低剂量秋水仙素的 NLN液体培养基进行短期培养 , 可以
获得较好的加倍效果 ( Zaki & D ickinson, 1995; Zhou & Hagberg, 2000; 周伟军 等 , 2002)。Mathias
和 Robbelen (1991)、石淑稳等 (2002) 对甘蓝型油菜小孢子植株试管苗进行加倍处理 , 获得了 50%
和 80%左右的加倍率。截止目前 , 羽衣甘蓝小孢子植株试管苗加倍处理还未见报道。本试验用含秋
水仙素的固体培养基处理单倍体试管苗 , 其二倍化频率达 54155%。
References
Duijs J G, Voorrip s R E, V isserD L, Custers J B M. 1992. M icrospore culture is successful in most types of B rassica oleracea L. Euphytica, 60:
45 - 55.
L ichter R. 1989. Efficient yield of embryoids by culture of isolated m icrospores of different B rassicaceae species. Plant B reeding, 103: 119 - 123.
J iang Feng2ying, Feng Hui. 2005. Embryogenesis and p lant regeneration of ornamental kale via isolated m icrospore culture. Acta Horticulturea
Sinica, 32 (5) : 884. ( in Chinese)
姜凤英 , 冯　辉. 2005. 羽衣甘蓝游离小孢子培养初报. 园艺学报 , 32 (5) : 884.
Mathias R, Robbelen G. 1991. Effective dip loidization of m icrospore2derived hap loids rape, B rassica napus L. by in vitro colchicines treatment.
Plant B reeding, 106: 82 - 84.
Shi Shu2wen, W u J iang2Sheng, Zhou Yong2m ing, L iu Hou2li. 2002. D ip loidization techniques of hap loids from in vitro culture m icrospores of
rapeseed (B rassica napus L. ) . Chinese Journal of Crop Sciences, 24 (1) : 1 - 5. ( in Chinese)
石淑稳 , 吴江生 , 周永明 , 刘后利. 2002. 甘蓝型油菜小孢子单倍体二倍化技术的研究. 中国油料作物学报 , 24 (1) : 1 - 5.
Tang Q ing2lin, SongM ing, Zhang Zhong2ling. 2000. The advances of studies on isolated m icrospore culture in cole crop s. Southwest China Journal
of Agricultural Sciences, 13 (3) : 98 - 103. ( in Chinese)
汤清林 , 宋　明 , 张钟灵. 2000. 甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究进展. 西南农业学报 , 13 (3) : 98 - 103.
Zhang De2shuang, Cao M ing2qing, Q in Zhi2wei. 1998. Embryogenesis and p lant regeneration of broccoli via isolated m icrospore culture. Acta Ag2
riculturae Boreali2Sinica, 13 (3) : 102 - 106. ( in Chinese)
张德双 , 曹鸣庆 , 秦智伟. 1998. 绿菜花游离小孢子培养、胚胎发生和植株再生. 华北农学报 , 13 (3) : 102 - 106.
ZakiM, D ickinson H. 1995. Modification of cell development in vitro: The effect of colchicines on anther and isolated m icrospore culture in B ras2
sica napus. Plant Cell Tissue O rgan Culture, 40: 255 - 270.
Zhou W J, Hagberg P. 2000. H igh frequency p roduction of doubled hap loid rapeseed p lants by direct colchicine treatment of isolated m icrospore.
Journal of Zhejiang University (Agric. & L ife Sci. ) , 26 (2) : 125 - 126.
Zhou W ei2jun, Tang Gui2xiang, Zhang Guo2qing, Hagberg P. 2002. Studies on efficient p roduction of doubled hap loid p lants by colchicine treat2
ment in m icrospore culture of B rassica napus. Scientia Agricultura Sinica, 35 (4) : 410 - 414. ( in Chinese)
周伟军 , 唐桂香 , 张国庆 , Hagberg P. 2002. 甘蓝型油菜小孢子秋水仙碱处理提高双单倍体频率研究. 中国农业科学 , 35 (4) :
410 - 414.
2201