全 文 ：中国油料 1 9 94 年第 6 1卷第 2期
芸蔓属植物未成熟小抱子培养技术的研究和应用 ’
余凤群
( 华中农业大学农学系 )
提要 从供体植株状态 、 取样 、 分离和培养方法 、 胚状体发生和小植株形成 、 再生植株性状表现
等方面研究芸签属植物未成熟小抱子培养技术 .这一技术与诱变 、 基因转化 、 原生质体融合 、性状遗
传研究 、 育种方法结合 .广泛应用于遗传和育种实践中 .
关键词 芸签属; 小抱子培养; 胚状体; 单倍体
在单倍体育种 中 , 花药培养和花粉培养是获得单倍体的主要途径 。花粉培养通常为未成熟
小抱子培养 , 简称小抱子培养 。 在芸荃属植物中 ,小抱子培养较花药培养效率高 ,且可排除母体
组织的影响〔。 . 1 9 8 2 年 , jL hc et r 首次报道 B 、 。 ca 。叩 。 。 小抱子培养形成植株〔幻 . 随后 ,这一
技术不断加以改进 ,加拿大 、英 国 、 德国均有报道 ,其中以加拿大所做 的研究工作最多 , 成果最
为突出 。 我国近年来才开展这方面的研究 。 到 目前为止 ,在芸盆属植物六个种 (B . : ” : .5 B .
ca
’ “` “ `a , B · J“ “ c e a , B · c o , , e女护 i“ , B · n i。 , a , B · o l e , a e e a ) 中均已成功地培养出小抱子再生植株 。
小抱子培养技术和这一技术在遗传育种应用上 ,开展了较为广泛的研究 , 并已成为规范化的常
规育种技术 ,也成为应用生物技术的一种有效手段 。
(一 )供体植株亲本类型与生长条件对小抱子胚状体形成的影响
不同亲本类型在同样试验条件下 , 小抱子培养的效率是有差别的 。 M at h i as 〔幻研究 6 个冬
油菜 F ; 杂交种 ,产胚数为每花药 0 . 15 一 2 . 26 个 ,小植株频率为 9 . 5肠一 37 . 9% . c h u o n g 〔幻用
12 个 刀 . : 。 p。 品系试验表明 , 产胚数 、正常胚频率和再生率分别为 4一 196/ 花药 、 6 %一 72 %
和 1% 一 47 % 。
供体植株生长的温度条件是影响小抱子培养的关键因子 〔习 。 B . : ” : s 品种 T oP as 生长在
16 小时光照培养室 中 , 白天 /晚上的温度分别为 10 ℃ 5/ ℃ 、 15 ℃ / 10 ℃和 20 ℃ / 15 ℃ ,平均每花
药产胚数分别为 20 0 个 、 10 个和 0个 。 这说明植株生长在较低的温度条件下 ( 10 ℃ 5/ ℃ ) ,有利
于胚状体的形成 。
种植密度对小抱子产胚量也有一定影响 。 c h u o n g 等〔们用 6 种亲本类型材料分别种植于
1 5c m 钵中 ,设每钵 1 株和 3 株两种密度 ,在 4 个亲本类型 中 , 高密度产胚量显著低 , 而另外 2
个亲本类型在两种密度上差异不显著 。
(二 )取样 、 分离和培养技术的研究
1
. 小饱予发 育时期 、 花蕾大 小 、 取样位笠 和取样时期的影响 小抱子的发育时期通常分为
单核期 、二核期和三核期 。 并非任何时期的小抱子都适于培养 ,在植物花药和花粉培养中 ,最适
于培养的时期通常为单核花粉期或二核花粉早期 ,芸墓属植物也是如此 .t4 幻 。 处于此期的小抱
子与花蕾形态指标如花蕾长度 、 花药长度 、花瓣长 /花药长的关系随 B 、 , ca 的种 、 品种及栽培
条件而异 〔` , 6 , , , ” , 。 例如 , K o t t 等 〔6 ,研究结果表明 ,甘蓝型油菜品种 T r i t o n 适宜的花蕾为 2 . 7一
3
.
g m m
, 花药长为 2 . 0一 2 . sm m , 花瓣长 /花药 比为 l 3/ 一 2邝 ,而 G 23 1这三项指标分别为 3 . 8
· 本文承蒙刘后利教授修改 ,特此致谢 !
中国油料 1 9 9 4年 第 1 6卷第 2期
一 4· 6m m , 2· 5一 3· o m m 和 2 / 3一 l 。 ,
c h u o n g 等〔` ,在 B · : a , 。 。三个亲本类型 ( R e g e n t . A l t e二和 xs u o u )的主花序 、 第一分枝的上
部第一花序和第二花序三个位置取花蕾 ,其胚产量无显著差异 。 他还用 4 种亲本类型做试验 ,
从始花期开始 ,在各亲本类型主花序上取蕾 6 个 ,每周取一次 , 共取 3 次 , 产胚量最多的为始花
一周后的花蕾 。
2
. 分离小艳子的方法 小抱子培养为游离细胞培养 。游离小抱子有两种方法 , 一是剥出花
药 ,将花药置于液体培养基上漂浮培养 , 任其散落花粉〔. 〕 。 二是直接磨碎花蕾、 过滤 、 离心分离
小抱子 ,悬浮于液体培养基中〔2 , . 目前绝大多数研究者采用第二种方法 ,但前者对小抱子不造
成损伤 。 樊哲 〔. ,还报道了用密度梯度离心的方法 (用 p e r c ol 与蔗糖混合 )分离小抱子 。
3
. 培养条件
( 1 )培养温度 c h u o n g 〔, “〕从 刀 . : a , 。 。 6个品种和 刀 . e 。 , i。 。 `。 一个品种中分离小抱子一 ,培
养在 2 一 32 ℃条件下均可产生胚状体 。 对大部分基因型来说 , 胚状体产生的频率在 32 ℃时最
高 ,低温培养 ,胚的质量较好 ,而变温处理 ( 32 ℃ 3 天 ,接着 25 ℃ 2 周左右 )效果最佳 ,可得到优
质高产的胚状体 。
(2 )振荡培养的作用 振荡培养有利于胚状体发育〔“ · 7· ” 一 ’ ` , 。 B ve e r s d of f 认为当胚可见时 ,
进行振荡培养 ,有利于胚快速一致发育 ,产生高比例的鱼雷形和子叶形胚 。
( 3) 激素种类和浓度 有关激素对胚形成和植株再生的影响 ,前人还未能取得一致结果 。
L ic ht e r 〔幻报道 ,培养基中省去植物生长调节剂可提高胚产量 。 c h ar en 〔 , 5〕附加 N A A 和 6 B A 培
养 B · 。 a p : : 两个 F , 杂种的小抱子 , 采用中央综合反应表面设计 ( e e n t r a l 一 e o m p o s i t e r e s p o n s e
s u r fa e e d e s i` n )的分析方法 , 在 6 B ^ 0 . 0 1一 0 . 2 5 5 m g / L 范 围内 , 产胚量与 6B A 浓度呈对数线
性增加 。 N A A 浓度在 0 . 136 一 1 . 85 m g L/ 范围内 ,对产胚量无影响 。 石淑稳 。 “ 〕报道附加 0 . 1或
0
.
sm g / L Z
,
4一 n 可显著促进小抱子分裂和胚状体产生 。 B e v e r s d o r f 〔’ ` ,应用 B 。 培养基附加 0 .
l m s/ L G A
: 或 .0 l m g / L G A : + 0 . 4m g / L B A ,有利于胚状体发育成小植株 .
( 4) 蔗糖浓度 芸墓属植物小抱子培养的培养基蔗糖浓度通常为 13 % 。 石淑稳 lt6 ,在含
13 %蔗糖的培养基上 , 小抱子能形成胚状体 , 而在 10 %蔗糖的培养基上未能长出胚状体 。 但
S at 。 〔川用含 10 %蔗糖的培养基培养 B . ca 二p e “ 凡。 亦产生了胚状体 。
(5 )基本培养基 诱导胚状体通常用 N L N 〔2 ,培养基 。 K e le r 〔 5,将大量元素降至 N L N 的 l/
2 时 ,提高了胚状体频率 ,而在 B S 和 M s 培养基上未能诱导形成胚状体 , 石淑稳试验表明 ,
N L N
、
K R 和 K 三种培养基均可诱导 B . 。 。 , 。 。 几个品种产生胚状体 ,从胚状体的频率和质量
看 , N L N 效果最佳 〔, ` , .
(6 )有毒物质的来源和对胚状体发育的影响 在培养过程中 ,有毒物质源于大量二核晚期
小抱子内含物〔“ ·“ ·了, ,但其化学成份还不清楚 。 有毒物质降低了胚状体频率 ,改变胚的形态 。 在
小抱子分离 24 小时后更换培养基或降低小抱子密度 ,可有效地降低毒素水平 。 jL hc t er 〔 , 2〕将活
性炭加入诱导培养基中 ,可消除有毒物质 。
(三 )胚状体发生和小植株形成
培养 3天内可见小抱子第一次分裂 , 7一 10 天 肉眼可见球形胚和心形胚 , 培养两周后进行
振荡 ( 6 0r p m , 20 ℃ ,黑暗 ) ,振荡一周达子叶阶段 〔 7 , 。 钟维瑾〔` ” 报道胚的发育较上述稍慢一些 。
C o ve nt r y 等 〔 , “ ,描述胚的早期发育按两种方式进行 : 小抱子分裂成多细胞线性个体 , 然后发育
成球形胚 ;先形成胚柄 , 然后形成多细胞鳞茎状胚 。 钟维瑾〔 ’ 3 ,报道 ,培养 25 夭形成子叶型胚 ,
转到分化培养基上 , 7一 10 天像种子发芽一样 , 子叶变绿 ,根伸长 ,接着形成 3一 4 片叶 ,而球形
中国油料 9 19 4年第6 1卷第2 期
胚和异常胚不能进一步发育 。
此外 , az ik cl . ,观察了单核小抱子晚期至离体培养条件下的小抱子第一次分裂过程中细胞
超微结构和细胞化学特征 ` s im m o n d。 等〔 2。 ,研究 T 刀 . : a , : 。 e v T o p a s (易形成胚 )和 0 0 2 5 (不
易形成胚 )两个品系小抱子培养过程中微管蛋白的变化 。 T ay l or 等〔 2` 〕和 w i b er s 〔 2] 等分别 比较
研究了小抱子胚和合子胚三酞甘油醋等化学组分的变化 .
(四 )再生植株的研究
1
. 染 色体加倍方法 小抱子植株群体中 ,大约 20 % 一 30 %是自然加倍的 , 自然加倍可能
来源于未减数的配子 , 或最初几次原胚的核内有丝分裂 〔均 。 加倍的方法通常有两种 ,一是先移
栽后加倍 。 iL hc et r 〔川用 0 . 2%秋水仙素注射次生花蕾 。 P ol so in 等〔力在开花时 ,根据花的形态判
断植株倍性 ,鉴别后将单倍体植株根洗净 ,用 0 . 1% 一 0 . 34 %的秋水仙浸泡 , 砍去植株上部 , 任
其重新生长 。二是先加倍后移栽 : M at hi as 〔脚将具有 3一 4 叶 , 1一 3 根的小植株通过无菌操作转
入 B ` 培养基中 , 附加 10 一 I OOm g / L 秋水仙碱功目倍后移栽到土壤中 。 开花时 ,根据花的形态和
花粉发育情况判断倍性 。 加倍效率最高为 5 0% , 秋水仙浓度为 s o om g / L ,处理时间为 4一 8 天 .
.
2
. 性状研 究 B e v e r s d o r f 〔 , ” 铂间试验 , 比较同一春油菜 e a n o l a 杂种的 n H (双单倍体 ,
d o u b一e d h a p l o id ) 、 s D (自然发生的二倍体 , s p o n t a n e o u s d i p l o i d )和 s s n (单粒种子的后代 , s i n -
gl e 。 e d de ce nt )三个系的几个数量性状 (种子产量 、成熟期 、蛋 白质 、 含油量和脂肪酸组分 )的
变化情况 。 还比较了同一杂交组合三个 D H 世代农艺性状和某些质量性状的变化 。
(五 )应用研究
1
. 培育杭除草 荆以及脂肪酸组分 突变植株 B , 。雨 ca 离体小抱子体系具有许多优点 〔25j ,
即单细胞群体大 、体细胞无性系变异小 、 隐性基因易于表现等 . eB ve r s d or fl( ` ,在小抱子分离之
后 , 用 丫射线或叠氮化钠处理 , 然后培养 、 选择 、 鉴定 , 已得到抗除草剂 C hl or s ul hP ur on 和
e 一y p h o s a t 。 的植株 。 P o一s o n i 〔7 ,和 s w a n s o n 〔 , , ,和 H u a n g 〔 , 6 ,亦分别得到了抗除草剂的小植株 。
H u a n g 除选出抗除草剂植株外 ,还得到饱和脂肪酸 (棕搁酸、 硬脂酸 )含量降低 、油酸含量增高
的突变体 . ’
2
. 提高隐性基因的选择效率 例如应用于黄籽和品质育种的结合 。 B . , “ 夕: : 种皮色泽由
三对基因控制 , 当三个位点作为隐性纯合状态 ( bl , bl ; bl : bl : bl : bl : )时为黄籽 。 用黑籽与黄籽杂
交 , F : 出现黄籽的频率为 1 / 6 4 ,而雄生系 (an d r og e in icl en ,即来自小抱子培养或花药培养的加
倍单倍体系 )黄籽频率为告。 低硫贰亦为三对隐性基因控制 , 用高硫贰和低硫贰亲本杂交 , F Z’ 目 万 ’ M 「 万 , 、 `
~
, J
~ 一 / 廿 8 , ’明 , . “ ” 、 7古 / 砂一 ` ’ 毋 ’ ~ ’一 ~ ~ 一 ’ ” 毋 ’ 尹 ’ J ’ , , 川 ” ~ n ’峭 , . “ ~ 司 、 ” 月、 ~ ’ 一 `
低硫贰个体的频率为兴。 用黄籽高硫贰与黑籽低硫贰亲本杂交 , F Z
U 任
黄籽低硫个体的频率为矗
` .
1 1 一 、 ` . , 一 一 ~ ~ 一~ ~ 一 、 , 1 _ 1 1 ~ 二 _ ~ . ~ . , 。 ~ . ` 一 一 : , … 一 ~ …
X 万丁 ~ 1下不下皿雄王杀页衬 1线硫认狈毕刀下 X 下~ 石1 。 囚此 ,利用小把士猎乔 , 叫天灭提局陈住
V 任 , V 刃 V O O V ,
基因 (2 “ , n 为基因对数 )出现的频率 , 为黄籽育种和品质育种的结合提供了有效途径 。 H en d卜
。 。 n 等 〔 7 ,报道黄籽 、低芥酸 、 高硫贰与黑籽双低油菜杂交 ,得到 F , 的 9 个 D H s 植株 , 3 株为黄
籽双低油菜 , x , 检验与兴无显著差异 。” J ` ~ ’明 `肖 产卜 , ` ’ ~ ~ 砂 6 4 / . ~ 侧一 2 ’ 。
3
. 利 用 小艳 子诱 导 的 植 株 群体 进 行遗传分 析 根 据 小 抱子诱导 的植 株群体 ( m i -
e r o : p o r e d e r iv e d p o p u l a t i o n ) 反映 F , 配子随机分离的假设 ,对小抱子诱导的植株群体进行遗传
分析 ,可消除常规方法 (自交 、 回交 )早代杂合位点 。 c h en 等 〔28) 分析了三个小抱子植株群体主
要脂肪酸的遗传 。 芥酸含量受两对主效基因控制 , 每一主效基因含两对加性效应等位基因 。 油
酸含量至少受两个遗传系统控制 ,一个负责链的伸延 , 另一个负责去饱和 。 亚麻酸符合三对基
中国油抖 1 94 9年第 1 6卷 第 2期
因加性作用模式 ,亚油酸含量符合两个位点遗传模式 。
4
. 以小艳于胚为受体实现基 因转化 在油菜小抱子培养中 , 主要通过微量 D N A 注射 〔293
和根癌农杆菌 ( A冬r o b a e t e r i u m t u m o fa e i e n e e )质粒导入 D N A 〔 , , , 两种方法实 现基 因转化 。
N eu h au
。 〔即报道 , 用含 N P T , 基因结构的 D N A 微量注射 , 8 周内得到大量再生植株 ,然后通
过 D N ^ d o t a n a 一y s i s ,转化效率为 2 7%一 5 1% 。 H u a n g 〔2 . , 应用根癌农杆菌转化 丑 . : 。 , : ; 。 v .
T o p as 的小抱子胚状体 ,转化效率为 O一 5% 。
5
. 以小袍子胚状休代替合子胚研究贮存蛋 白基 因的表达 贮存蛋白基因的表达是分子生
物学中重要的研究课题 。 在 B . : 。 p : 。 中 , 已证明外源 A B A 处理可显著影响贮存蛋白基因的表
达 ,但进一步研究时遇到一些困难 。 例如 ,在活体合子胚中不易掌握 A B A 的水平 ,得到大量早
期胚有困难 ,合子胚中 A B A 的来源不清楚等 。 w l e n 〔30) 用小抱子胚代替合子胚 ,克服了上述困
难 ,进一步阐明了贮存蛋白基因的表达
6
. 雄性不育系小艳子的培养 c h u o n g 等 〔们培养具微量花粉的雄性不育系小抱子 , 用于细
胞质融合 。 在 P ol 一 c m s 和 M ur 一 c m s 的小抱子培养中 ,发生胚状体的频率很高 ,并认为低密度的
小抱子有利于胚状体发育 ,小抱子胚的发生可能与细胞质有关 。
7
. 产生加倍的单倍体植株用于 R F L P 分析 R F L P ( R e s t r i e t i o n F r a g m e n t L e n g t h P o l-y
m or hP is m )遗传标记的分析 ,要求亲本纯度高 、两亲差异大 。 而芸荃属植物为常异交或异交植
物 ,普通品种很难达到高度纯合的要求 , 加倍单倍体植株是非常纯的 。 K ej hc 〔” 应用小抱子培养
技术 ,产生纯合的春油菜和冬油菜亲本 。 用冬油菜 x 春油菜或冬油菜 x 人工合成 的 B . : 叩 。 。 ,
其 尸 , 用于 R F L 分析 。
1 6
l 7
2 1
2 2
2 3
2 4
10
l l
2 5
2 6
2 7
2 8
l 3
14
参 考 文 献
S i e b e l J . t a l
.
T A G
, 1 98 9
, 7 8 ( 4 )
:
47孚 4 7 9
L 祀h t . r R e t a l . P l a n t B r e e d . 1 9 8 2 , 10 5 : 4 2 7一 4 3 4
M
a t h沁 R e t a l . P r o e . 7 t h nI t e r n . R a P e s e e d C o n s ,
19 8 8
,
1 58
一
16 1
C h u o n g P V e t a l
.
C a n
.
J
. 加 t 19 88 , 6 6 ( 8 ) : 16 5 3 -
16 5 7
,
1 67卜 1 6 8 0
K e l l e r W A
. t a l
.
P roc
.
7 t h I n t e r n
.
R a Pe s e e d C o n g
.
19 8 8
,
1 5 2
一
15 7
K o t t L 5 . t a l
.
C a n .J B o t
,
1 9 8 8
,
6 6 ( 8 )
:
16 5 8 一 16 6 4 ,
16 6 5
一
1 6 7 0
p o l s on 立L e t a l
.
c . n
.
J
.
BO t
,
1 9 8 8
,
6 6 ( 8 )
, 16 8 1一 1 6 8 5
郑祖玲等 . 上海农业学报 , 19 86 , 2 ( 3 ) : 9一 16
F a n 2 e t a l
·
P r co
·
7 t h b t e r n R a P e s 七 e d C o n g
,
1 9 8 8
,
9 2
-
9 6
C h u o n g P V o t a l
.
P l a n t S e i
,
1 9 8 5
,
3 9 ( 3 )
:
2 19
一
2 2 6
取 vc r s d o r f W D e t a l . P r oc . 7 t h In t e r n . R a P e s e e d
C o n g
.
19 8 8
,
8 6
一
9 1
L i e h t e r R e t a l
.
P l a n t B r e e d
,
1 9 8 9
,
1 03 ( 2 )
:
1 1 9一 1 2 3
钟维瑾等 . 上海农业学报 . 1 9 9 0 . 6 ( 4 ) : 1 1一 1 6
hZ
o n s , W J
e t a l
.
P roc s t h nI t e r n
.
R a P e s e e d C o n g
,
1 99 1
,
1 07 1一 1 0 7 4
2 9
3 0
C h a r n e D G e t a卜 C a n J . B o t , 1 9 8 8 , 6 6 ( 8 ) * 1 6 7 1 一
1 6 75
石淑稳 . 华中农大油菜研究年报 , 19 9 2 , 4 0一 42
S a t o , T e t a l
.
P l a n t C e l一R e P o r t s 19 8 9 , ( 8 ) : 4 8 6一 4 8 8
C o vc n t r y J
e t a l
.
M a n u a l fo r M ic r os Por
e e u l f u r e 咤e e h -
n i q u e fo r B r a s s i e a n a P u s
,
1 9 8 8
,
2 3
一
2 4
aZ k i M ^ M
e t a 一 P r o t o p一a s m a , 1 9 9 0 , 1 5 6 ( 3 ) : 1 4乐
1 6 2
5 im m o n d s D H e t a l
.
P roc
.
s t h nI t e r n
.
R a沐 s e cd
C o n g , 19 9 1 ( l )
:
3 0 6
一
3 1 1
T a y l o r D C e t a盛. P l a n t P h y s i o l , 1 9 9 1 , 9 7 ( 1 ) : 6导 7 9
W ib
e r s E e t a l
.
T A G
,
1 9 9 1
,
8 2 ( 4 )
:
5 1 5
一
5 2 0
M a t h认5 R e t a l . P l a n t B r e e d ,. 1 9 9 1 , 10 6 ( l ) : 8 2一 8 4
L i e h t o r R e t a l
.
P l a n t B r e de
,
1 9 8 8
,
10 0 ( 3 )
:
2 0乐 2 2 1
S w a n s o n E B 七 t a l
.
T A G
。
19 8 9
,
7 8
:
5 2 5
一
5 3 0
H u a n s H e t a l
.
P r o e
.
s t h nI t e r n
.
R a pe s e e d C o飞 , 1 9 9 1
( l )
:
2 9 8
一
3 0 3
H e n d e r s o n C
,
^ P e t a l
.
T ^ G
. 1 9 9 2
,
8 3 ( 4 )
:
4 7 6
一
4 7 9
e h e n P
.
V e t a l , T A G , 1 99 0
, 8 0 ( 4 )
:
4 6 5一 4 6 9
N e u h a u s G e t a l
.
T A G
, 1 9 8 7
, 7 5
:
3吞 3 6
W i l e n R W
e t a 一, P l a n t p h y s io 卜 19 9 0 , 9 4 ( 3 ) : 8 7导 8 8 1
K e i t h D J e t a l
.
A n n u a l R e OP
r t , 1 99 0
, 14
一
15