全 文 ：园 艺 学 报 2005, 32 (1) : 15～19
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 05 - 28; 修回日期 : 2004 - 08 - 033 通讯作者 Author for correspondence
番木瓜茎尖超低温保存过程中的细胞超微结构
曾继吾 1, 2 易干军 13 张秋明 2 周碧容 1 吴元立 1
(1 广东省农业科学院果树研究所 , 广州 510640; 2 湖南农业大学园艺园林学院 , 长沙 410128)
摘 要 : 采用透射电子显微镜对番木瓜 (Carica papaya L. ) 茎尖超低温保存过程中细胞超微结构变化进
行观察。结果表明 : 细胞在经过预培养、60% PVS2 预处理和 PVS2 脱水处理 , 细胞质壁分离程度逐渐加重 ,
细胞的抗冻力增加。细胞严重伤害主要发生在液氮保存的降温及解冻的过程中 , 一部分细胞的细胞壁、细胞
膜以及细胞核膜均有不可逆的损伤 , 可能是导致部分细胞致死的原因之一。也有部分细胞结构完整 , 虽然细
胞结构发生了变化 , 但是程度不深 , 是可逆的伤害 , 在恢复培养 3 d时可自动修复 , 然后再生出植株。
关键词 : 番木瓜 ; 超低温保存 ; 玻璃化法 ; 超微结构
中图分类号 : S 668 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2005) 0120015205
Cell Ultra structure of Papaya Shoot2tip dur ing Cryopreserva tion
Zeng J iwu1, 2 , Yi Ganjun13 , Zhang Q ium ing2 , Zhou B irong1 , and W u Yuanli1
(1 F ruit Research Institu te Guangdong A cadem y of A gricu ltura l Sciences, Guangzhou 510640, China ; 2 College of Horticulture,
Hunan A gricultura l U niversity, Changsha 410128, Ch ina)
Abstract: The shoot2tip s of papaya was used to study ultrastructural changes during cryop reservation by
vitrification. U ltrastructure of cryop reserved cells was observed by using the transm ission electron m icroscopy
( TEM ). The results showed that the p lasmolysis became more and more severe during the p retreatment and
dehydration after the shoot2tip swere p recultured. Meanwhile, itwas able to imp rove the desiccation and freeze
tolerance. Cells were mainly damaged during the freezing and thawing p rocess. Some cells were extensively
damaged, including cell walls, cell membranes and nucleus envelopes were lethally injured during cryop reser2
vation period, which may account for the death of some cells after cryop reservation. On the other hand, there
were also many cells, which were basically sim ilar to that of control material. The cells were able to repair
such damage and regain their normal ultrastructure within three days in culture. They could survive and regen2
erate p lantlets after cryop reservation.
Key words: Papaya (Carica papaya L) ; Cryop reservation; V itrification; U ltrastructure
超低温保存 (Cryop reservation) 技术是指在 - 80℃的超低温条件下保存生物材料 , 通常是指在液
氮 ( - 196℃) 下保存生物材料 , 被认为是目前保存植物种质资源的理想方法。20世纪 80年代末 ,
玻璃化法 (V itrification) 超低温保存方法开始应用于植物种质资源保存之中 , 该方法主要是用复合高
渗溶液 ———植物玻璃化溶液 ( PVS) 处理植物样品 , 然后将其迅速投入到液氮下保存 , 它具有设备要
求简单、效果和重演性好等优点 , 现已成功应用于柑橘〔1, 2〕、杏〔3〕、苹果和梨〔4〕、云杉〔5〕、甘薯〔6〕、
柿〔7〕等植物组织和细胞保存上。番木瓜 (Ca rica papaya L. ) 是一种重要的多年生常绿果树 , 广泛分
布于热带和亚热带地区。番木瓜株性复杂 , 对多种病毒敏感 , 实生苗后代性状容易分离 , 采用超低温
保存其茎尖有实际意义。我们已经成功对番木瓜茎尖进行了超低温保存 , 成活率和再生率分别达
5313%和 5116%〔8〕。
植物细胞或组织在超低温保存过程中 , 对生物材料造成的损伤是多方面的。目前已有一些学者利
用电子显微镜观察了糜子 ( Panicum m ax im um ) 悬浮细胞〔9〕、红豆草〔10〕、水稻〔11〕胚性悬浮细胞、香
园 艺 学 报 32卷
蕉茎尖〔12, 13〕等材料在超低温保存过程中超微结构的变化。本研究利用透射电镜 ( transm ission electron
m icroscopy, TEM ) 对番木瓜茎尖在玻璃化法超低温保存过程中 , 细胞脱水、收缩变形以及细胞器主
要变化情况进行观察 , 以期为植物超低温保存技术提供一些研究基础。
1 材料与方法
111 植物材料
供试材料为广东省农业科学院果树研究所试验果园内番木瓜栽培品种穗中红 , 经常规灭菌 , 将茎
尖培养在 MS +BA 015 mg/L +NAA 011 mg/L + GA3 110 mg/L的培养基上 , 获得无菌苗。取继代 3～4
次 , 生长健壮的无菌芽为材料进行超低温保存〔8〕, 即取长度为 3～5 cm的茎尖 , 在含有 5%二甲基亚
砜 (DMSO) 培养基上预培养 3 d, 解剖镜下剥取含 1～2个叶原基的茎尖 (115～215 mm长 ) , 先在
室温下用 60%的玻璃化溶液 〔PVS2 30%甘油 ( Gly ) + 15%乙二醇 ( EG ) + 15%二甲基亚砜 (DMSO)
+ 014 mol/L的蔗糖 〕中装载 40～50 m in, 再用 PVS2 于 0℃下处理 30 m in, 换 1次 PVS2溶液后 , 迅速
投入液氮。保存 24 h后 , 在 40℃水浴中化冻 , 用 112 mol/L的蔗糖培养液洗涤两次后 , 转入继代培
养基。
分别取以下茎尖作为电镜观察材料 : (1) 正常生长的离体培养茎尖 (对照 ) ; (2) 在 5% DMSO
+ 5% 蔗糖 +MS基本培养基上预培养 3 d后的茎尖 ; (3) 经 60% PVS2和 PVS2溶液中脱水后的茎尖 ;
(4) 在液氮中保存 24 h后迅速解冻的茎尖 ; (5) 恢复生长 3 d后的茎尖。
112 超微结构观察样品固定处理和观察
透射电镜制片和观察参照柯冲等〔14〕的方法 , 把经过处理后的茎尖 , 放在预先配制好的 4%戊二醛溶
液 (用 011 mol/L二甲胂酸钠缓冲液配制 , pH 711) 中固定保存 (0～4℃) , 然后进行超薄切片制备 :
(1) 用 011 mol/L二甲胂酸钠缓冲液将上述前固定的材料进行洗脱 ; (2) 用 2%的四氧化锇 (缓冲液同
前 ) 在 0～4℃下进行后固定 2 h, 再洗脱 ; (3) 用 30%、50%、70%、80%、90%和 100%的乙醇进行
逐级脱水 ; (4) 用环氧树脂 Epon 812渗透包埋 ; (5) 把渗透后的样品和标记放入装有包埋剂的胶囊中
包埋 ; (6) 将胶囊放入恒温箱中 , 60℃恒温聚合 3～4 d; (7) 用锋利刀片将包埋块修整成顶部锥状 , 显
出样品 ; (8) 将修理好的样品装在 LKV2Ⅲ型超薄切片机上切片 ; (9) 用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对超薄
切片进行染色。最后 , 将制备好的超薄切片在 JEM21010型透射电镜下观察并拍照。
2 结果与分析
211 正常生长组培苗的超微结构
番木瓜茎尖培养在 MS +BA 015 mg/L +NAA 011 mg/L + GA3 110 mg/L的培养基上 , 无菌芽生长
旺盛 , 平均每 25～30 d继代 1次 , 细胞结构特征是 : 细胞结构完整 , 中央有一个细胞核 , 形状正常 ,
其中有一个染色较深的核仁 (图版 , 1) , 细胞质浓 , 细胞含有多个大小不一的液泡 , 核膜规则 , 双
层膜结构清楚 (图版 , 2)。说明这是一个代谢正常、结构完整、正在进行分裂的细胞。
212 预培养 3 d后的细胞超微结构
从组培苗上切取长度约为 3～5 cm, 转移到含 5% DMSO + 5%蔗糖 +MS基本培养基上进行预培
养 , 这可以脱除细胞内部分自由水 , 保持细胞膜的稳定结构 , 提高抗冻力。经过 3 d预培养 , 细胞中
出现了体积较小的液泡 (图版 , 3) , 细胞质中间出现了比较多的淀粉粒 , 细胞质变浓 , 细胞间隙变
得明显 , 质膜的双层膜结构清晰可见 (图版 , 4) , 出现轻微的质壁分离 , 但仍然可见细胞与细胞之
间有胞间连丝连接 (图版 , 5)。
213 在 60%PVS2和 100%PVS2溶液中脱水后的细胞超微结构
玻璃化法的关键步骤是采用 PVS2对细胞进行脱水处理 , 为了减少渗透压变化过于剧烈 , 先用
60%的 PVS2进行初步脱水处理 , 即所谓的装载过程 , 然后再用 100% PVS2脱水处理〔2〕。经过了 60%
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1期 曾继吾等 : 番木瓜茎尖超低温保存过程中的细胞超微结构
PVS2和 100% PVS2处理一段时间后 , 细胞内进一步脱水 , 质壁分离变得很明显 (图版 , 6～8) , 细胞
中大液泡变小 , 细胞基质变浓 , 部分细胞质与细胞壁之间出现了比较大的空腔 , 质膜表面有不规则的
突起 , 产生空泡现象 , 或内陷形成囊泡 (图版 , 7、8) , 有的细胞器被破坏 , 细胞质匀质化 , 胞液外
流到由于质壁分离的空腔内 , 淀粉粒大多数破裂 , 细胞内部分呈空腔状 (图版 , 7、8)。发生严重质
壁分离的细胞之间以及细胞内部之间的联系可能被打断 (图版 , 8)。从结构上看 , 细胞在这些处理
中已经受到一定的伤害 , 这可能是 PVS2对细胞造成毒害的原因之一。但此时仍有部分细胞核受伤害
不明显 , 染色深 , 核膜规则 (图版 , 9)。
214 在液氮中保存 24 h后的细胞超微结构
细胞经过液氮保存后 , 结构上发生很大变化 , 细胞内出现较大的空腔 , 原生质体浓缩 , 细胞核和
细胞质被挤到一块 , 细胞器被严重破坏 , 胞基质被水解 , 质壁分离十分严重 , 胞间连丝断裂 (图版 ,
10) , 细胞器变模糊 , 细胞质匀质化 , 呈纤维状 (可能是因为温度剧烈变化 , 导致一些细胞器解体后
留下的碎片 ) (图版 , 11) , 这些细胞遭受到致死伤害。质膜破裂或者变得凹凸不平 (图版 , 10、11)。
细胞核着色变淡 , 核膜变形 , 核膜周围有一系列似液泡的空腔 (图中箭头所示 ) (图版 , 12) , 细胞
核内出现大空腔 , 内有纤维状的物质 , 核周隙扩张即双层膜之间空腔加大 (图版 , 12) , 可能是结冰
或解冻等过程对细胞造成伤害 , 这与 W ang等观察超低温保存后水稻悬浮细胞结果类似 , 他认为核周
隙的变化是因为在冰冻过程中 , 相邻近的核孔复合体破裂所致〔11〕。有些细胞壁变形十分严重 (图版 ,
13) , 这可能是在超低温保存的冷冻过程中 , 细胞内结冰 , 解冻时细胞壁与原生质体的恢复不同步 ,
细胞壁发生了不可逆变化而导致细胞壁破裂。也有些细胞虽然有少量的质壁分离 , 但细胞结构完整 ,
胞间连丝完好 (图版 , 14、15) , 这些细胞经过了保护剂处理后 , 能耐温度剧烈变化 , 在超低温保存
过程中伤害不十分严重。经过恢复培养后 , 能够由此再生成植株。
215 恢复生长 3 d后的细胞超微结构
经过液氮保存后的细胞迅速解冻后 , 放在培养基上恢复培养 3 d。从表面上看 , 细胞颜色已经开
始变绿 , 其超微结构如图版 16, 部分细胞结构已恢复似对照 , 细胞器恢复成形 , 细胞核染色深 , 中
央有 1个着色深的核仁 , 细胞结构完整。这些细胞分裂加速 , 代谢加强。而另外一些未恢复的细胞仍
然严重质壁分离 , 细胞质凝集成团或呈碎片状 , 不均匀分布在细胞内 ; 质膜结构遭到损伤 , 发生了不
可逆的损伤 , 遭到了致死伤害 (图版 , 17)。
3 讨论
在超低温保存中 , 保存后材料的成活率、保存后细胞超微结构的变化情况与其处理过程密切相
关 , Gnanap ragasam等〔9〕观察了糜子悬浮细胞超低温保存后超微结构表明 , 不用冰冻保护剂进行快速
降温时 , 细胞器增大 , 内质网膨胀形成泡囊 , 细胞内形成冰晶 ; 使用适当冰冻保护剂时 , 虽然细胞变
形、原生质浓缩 , 但产生较少的伤害 , 细胞器改变不大 , 解冻后细胞结构、细胞器可恢复正常 ; 孙龙
华等〔9〕用电镜观察了红豆草采用不同降温方法保存后的超微结构 , 发现用快冻法保存的细胞存活率
为零 , 其结构变化很大 , 而采用慢冻法保存后存活率为 66% , 其细胞结构变化较少 , 这说明保存过
程中细胞结构的变化与成活率有关。
通过观察番木瓜茎尖在超低温保存过程中细胞结构的变化表明 , 材料经过预培养后 , 细胞内液泡
变小 , 自由水含量降低。这种细胞超微结构的变化是抗冻力和抗脱水力提高的标志 , 是和生理学上的
变化相平行的。采用高浓度的冰冻保护剂 ( PVS2 ) 对材料进行脱水处理 , 是为了脱去细胞内一部分
自由水 , 降低其冰点 , 提高其重结晶点 , 以尽快越过冰晶形成期 , 使体细胞在快速冷冻时进入玻璃化
态而减少冰晶形成 , 但同时 , 冰冻保护剂本身会对材料造成伤害 , 脱水会使细胞发生质壁分离 , 细胞
膜和一些细胞器发生不可逆变化 , 给细胞带来损伤。从本研究的结果看 , 细胞在冰冻降温和解冻过
程 , 细胞器、细胞膜及其膜结构遭到致命伤害 , 与 Helliot等〔12, 13〕观察香蕉茎尖超低温保存中结果相
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园 艺 学 报 32卷
似。W ang等认为细胞在经过保护剂处理和冷冻保存后 , 核周隙扩张 , 可能是在细胞失水和复水的过
程中 , 胞质比核质的复水速度快 , 当细胞的质壁分离已经恢复时 , 细胞核的皱缩状态不能完全恢复 ,
使邻近的核孔复合体破裂 , 核膜上有较大的空隙 , 导致细胞核变形十分严重 , 原生质体严重收缩 , 各
种细胞器及膜结构普遍遭到破裂 , 显示出严重伤害〔11〕。在本研究中 , 另一些细胞 , 经过保护剂处理
后 , 抗冻能力提高 , 表现在细胞结构上是只有轻微变形 , 而未造成细胞器和膜结构的明显破坏 , 经再
培养 3 d后 , 细胞结构所受的伤害大多数可以得到恢复。由超微结构上看 , 我们所采用超低温保存试
验方案是可行的。
在超低温保存过程中 , 使细胞超微结构发生较大变化是在冷冻和解冻过程中。因而 , 如何进一步
优化保存过程 , 使细胞在保存中达到完全玻璃化 , 是研究超低温保存材料的关键。今后应从生理与分
子水平上进一步探索冻害机理 , 提高材料的保存效果。
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1期 曾继吾等 : 番木瓜茎尖超低温保存过程中的细胞超微结构
图版说明 : 1～9. 液氮保存前番木瓜茎尖的超微结构 〔1. 对照细胞 , 有比较大的液泡 ; 2. 对照细胞核结构 , 核膜规则 ; 3～5. 经过
预培养后番木瓜茎尖超微结构 (3. 液泡体积变小 ; 4. 轻微质壁分离 ; 5. 胞间连丝存在 ) ; 6～9. 用 PVS2 脱水处理后番木瓜茎尖超
微结构 (6. 产生轻微质壁分离 ; 7. 产生严重质壁分离 ; 8. 产生严重的质壁分离 , 质膜部分发生变形 ; 9. 发生一些变形的细胞
核 ) 〕; 10～17. 番木瓜茎尖在液氮中保存 24 h后的细胞超微结构 〔10. 发生严重质壁分离和严重损伤的细胞 ; 11. 发生严重损伤的
细胞 , 细胞器损伤厉害 ; 12. 严重受损伤的细胞核 ; 13. 发生受损伤 , 细胞壁被撕裂 ; 14. 发生轻微损伤的细胞 ; 15. 发生轻微损伤
的细胞 , 胞间连丝完好 ; 16, 17. 超低温保存后 , 恢复培养 3 d后的细胞的超微结构 (16. 成活的细胞结构 , 其结构似对照 ; 17. 致
死的细胞结构 ) 〕。
Pl. 质膜 ; M. 线粒体 ; Ap. 淀粉粒 ; CW. 细胞壁 ; CM. 细胞膜 ; N. 细胞核 ; Ne. 核膜 ; Nu. 核 ; Ch. 染色质 ; Cy. 细胞质 ; V.
液泡
Explana tion of pla tes: 1 - 9. The ultrastructures of papaya shoot2tip s ( control) before cryop reservation 〔1. Control cell with a larger vacuole;
2. Normal nucleus envelope; 3 - 5. The ultrastructures of papaya shoot2tip s after 32day p reculture on a MS medium supp lemented with 5% DMSO
(3. Cells with numerous smaller vacuoles; 4. The undulations of the p lasma membrane caused by partial p lasmolysis; f. multi2membranous
structures; 5. The cells contactwith p lasmodesmata) ; 6 - 9. The ultrastructures of papaya shoot2tip s after dehydrate with PVS2 (6. M inor p las2
molysis ; 7. Severe p lasmolysis; 8. Severe p lasmolysis and abnormal p lasmalemma; 9. M inor changed nucleus) 〕; 10 - 17. The ultrastructures
of papaya shoot2tip cooled in LN and held there for 24 hour after cryop reservation 〔10, 11. The cells of severe p lasmolysis; 12. Injury nucleus;
13. Rup tured cell wall; 14. The structure of m inor injury cell; 15. The p lasmodesmate is normal after cryop reservation; 16, 17. The ultra2
structure of after 3 days of recovery culture (16. The ultrastructure of surviving cells, its ultrastructure is sim ilar to that of the control; 17. The
ultrastructure of lethal injury cells) 〕.
Pl. p lasmalemma; M. m itochondrium; Ap. amylop last; CW. cell wall; N. nucleus; Ne. nucleus envelope; Nu. nucleolus; Ch. chromatin;
Cy. cytop lasm; V. vacuole
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