全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 52～57
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 03 - 22; 修回日期 : 2005 - 09 - 19
基金项目 : 中—荷联合园艺作物基因组技术实验室资助项目 (2001CB711102) ; 农业部 ‘蔬菜遗传与生理重点实验室’资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yongchen1du@mail1caas1net1cn) 。感谢荷兰 W ageningen大学植物病理实验室的全
体成员。
番茄 Cf242Avr4互作系统中信号转导基因的克隆与
功能分析
刘　庆　冯东昕　王晓武　杜永臣 3
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 通过基因序列分析从抗叶霉病的番茄 (含 Cf24基因 ) 中筛选出 1个参与植物过敏反应的基
因 RGL (Resistance Gene L ike)。采用酵母双杂交方法 , 从番茄 cDNA文库中筛选出两个与该基因的编码蛋
白发生互作的蛋白 , 分别命名为 RGL IP21和 RGL IP22 (RGL Interacting Protein)。RGL IP21全长 291个氨基
酸 , 与类囊体内腔蛋白同源性较高 , RGL IP22全长 248个氨基酸 , 与拟南芥转导素高度同源。利用病毒诱
导的基因沉默 (V irus2Induced Gene Silencing, V IGS) 技术进行了基因功能分析。结果表明 , 这两个互作蛋
白参与了与植物抗病相关的过敏反应 (Hypersensitive Response, HR)。
关键词 : 番茄 ; 叶霉病 ; 过敏反应 ; 酵母双杂交 ; 病毒诱导的基因沉默
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120052206
C lon ing and Functiona l Ana lysis of the Genes Involved in S igna l Tran sduc2
tion in Toma to C f242A vr4 Pa thosystem
L iu Q ing, Feng Dongxin, W ang Xiaowu, and Du Yongchen3
( Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricultura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: The Hypersensitive Response (HR) is one of the most efficient and common disease resist2
ance mechanism s in p lant. Cloning signaling genes is very important to elucidate the resistance mechanism s. A
gene in tomato with homology to several resistance p roteins involved in HR in p lant, was indentified and desig2
nated as RGL (Resistance Gene L ike). RGL p rotein was used as bait to screen interacting p rotein ( s) from
tomato cDNA library through yeast two2hybrid system. Two interacting p roteins designated as RGL IP21 and
RGL IP22 (RGL Interacting Protein) respectively were found. RGL IP21 is a p rotein of 291 am ino acids with
significant homology to thylakoid lumen p rotein. RGL IP22 is a p rotein of 248 am ino acids with significant ho2
mology to transducin p rotein. V irus2Induced Gene Silencing (V IGS) of the two genes resulted in a partial and
comp lete supp ression of A vr42induced HR, indicating that both genes are involved in hypersensitive response.
Key words: Tomato; C ladosporium fu lvum ; Hypersensitive response; Yeast two2hybrid system; V i2
rus2induced gene silencing
番茄叶霉病是番茄生产中特别是保护地生产中的主要病害之一 , 现在已知番茄抗叶霉病的作用机
制是过敏反应。过敏反应 (HR) 是植物最普遍的抗病机制之一 , 是在植物抗病基因的编码蛋白与病
原物无毒基因编码产物激发子互作后 , 通过一系列信号转导途径而被诱导产生。叶霉病菌 C ladospori2
um fu lvum (Cf) 和番茄的互作是研究这种抗病机制的理想模式系统 , 该真菌的 4个无毒基因 (A vr2,
Avr4, A vr4E和 A vr9) 和番茄对应的抗病基因 ( Cf22, Cf24, Cf24E和 Cf29) 已经被克隆〔1～4〕。研究表
明 , 在马铃薯和烟草中 , Cf与 A vr的互作也能诱导细胞死亡〔5, 6〕, 表明引发 HR的信号转导途径在茄
科植物中是保守的。因此 , 克隆 HR信号转导途径中的基因对于进一步了解 HR反应的生成机制和最
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　1期 刘 　庆等 : 番茄 Cf242A vr4互作系统中信号转导基因的克隆与功能分析 　
终利用 HR反应培育广谱持久抗病品种具有重要的意义。尽管 HR反应机制已研究多年 , 但 HR信号
转导的整个过程依然不清楚 , 有必要进一步挖掘构成 HR信号转导途径的其它未知组分。
酵母双杂交技术专门用于研究蛋白与蛋白、与核酸、与小分子配体等相互作用 , 尤其在细胞信号
转导研究中具有重要的应用价值。病毒诱导的基因沉默体系在植物上的建立〔7, 8〕为大规模验证基因的
功能提供了强有力的工具。目前 V IGS技术在植物抗病方面应用的最多〔9〕。
为了研究番茄植株上 HR信号转导过程 , 荷兰 W ageningen大学的 Frank等人利用 V IGS技术 , 对
先前筛选的 HR反应差异表达基因片段进行了功能分析 , 并获得 20个使 HR反应丧失或减弱的基因
片段。本文对其中的 5个片段进行了全长基因序列分析 , 从中筛选出一个 RGL基因 , 并用酵母双杂
交和 V IGS技术对与该基因的编码蛋白发生互相作用的蛋白进行了功能分析。
1　材料与方法
111　材料
真核表达载体 pGBKT7、大肠杆菌 DH5α、酵母菌株 PJ6924a、接种蚜虫的番茄全长 cDNA文库、
Cf24转基因烟草、含双元表达载体 pRH78 ∶A vr4 的农杆菌 GV3101、含各种 V IGS载体的农杆菌
GV3101、TRV∶00 (空的病毒载体 )、TRV∶RGL (含 RGL的病毒载体 ) 均由荷兰 W ageningen大学植物
病理实验室提供。
高保真的 Taq酶购自 TaKaRa公司 , N coⅠ、Sm aⅠ和 Sa lⅠ购自 Promega公司。
112　方法
11211　参与 HR反应的基因的序列分析 　将已筛选出的 5个参与 HR反应的基因核苷酸序列翻译成
氨基酸序列 , 并提交给 GenBank数据库 , 用 BLASTp进行同源性分析和查找保守功能结构域。
11212　酵母双杂交系统重组质粒的构建 　根据全长的 RGL基因序列设计引物 , 并在正向引物中引入
N coⅠ的酶切序列 , 以 RGL 基因为模板进行 PCR扩增。所用引物序列为 : F: 5pi2GGGATCCATGGTT2
GATGTAGGGGTTGA 23pi, 引入 1个 N coⅠ位点 ; R: 5pi2 GGGGCATGTTCAATATGTCT 23pi。
从凝胶中回收并纯化 PCR产物 , 然后用 N coⅠ酶切 PCR产物 , 电泳 , 从凝胶中回收酶切产物 ;
同时用 N coⅠ和 Sm aⅠ分别酶切 pGBKT7 (BD质粒 ) , 电泳 , 从凝胶中回收酶切产物。将 RGL基因的
PCR酶切产物与 pGBKT7酶切产物连接 , 形成诱饵质粒 pGBKT7 /RGL。另外采用内删除法将番茄全长
cDNA的噬菌体文库转为 AD质粒文库。
11213　双质粒的酵母共转化与筛选 　参照 Clontech公司的说明书 , 采用醋酸锂转化法将诱饵质粒
pGBKT7 /RGL与番茄全长 cDNA的 AD质粒文库共同转化酵母菌株 PJ6924a, 首先在 Try- /Leu - 培养
基上筛选含有双质粒 (AD质粒和诱饵质粒 ) 的酵母菌株 , 然后在 Try- /Leu - /Ade - /H is- 选择培养基
上继续筛选 , 28℃培养 48 h。挑取直径大于 2 mm的浓密菌落 , 再于 Try- /Leu - /Ade - /H is- 选择培养
基上进行 1次筛选 , 最后从筛选出来的候选阳性克隆中分离出 AD质粒 , 并与空的 BD质粒共转化酵
母 , 进行自动激活检测筛选 , 直径显著小于诱饵质粒和 AD质粒共转化的对照酵母的克隆为阳性克
隆 , 最后分离出 AD质粒 , 测序并分析。
11214　V IGS载体的构建　根据筛选出来的两个互作蛋白基因的序列设计引物 , 并分别在正反引物中
引入 B am HⅠ和 A sp718的酶切序列 , 以各自相应的基因为模板进行 PCR扩增。所用引物序列如下 :
互作蛋白基因 1: F: 5pi2CTGGATCCGACTGTATACTCTCACTGGA23pi, 引入 1个 B am HⅠ位点 ; R:
5pi2CTGGTACCAGTTCATACTTACCAACTCCAG23pi引入 1个 A sp718位点。
互作蛋白基因 2: F: 5pi2CTGGATCCATTCCAAGTTATCGAATCCA23pi, 引入 1个 B am HⅠ位点 ; R:
5pi2CTGGTACCGGTAGGTGAAGGCTTCAACT23pi, 引入 1个 A sp718位点。
从凝胶中回收并纯化 PCR产物 , 然后分别用 B am HⅠ和 A sp718酶切 PCR产物 , 电泳 , 从凝胶中
回收酶切产物 ; 同时用 B am HⅠ和 A sp718分别酶切空的 V IGS载体 TRV∶00, 电泳 , 从凝胶中回收酶
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切产物。分别将两个 PCR酶切产物与 TRV∶00酶切产物连接 , 形成 TRV∶RGL IP21和 TRV∶RGL IP22,
最后转化农杆菌 GV3101。
11215　通过 V IGS技术分析互作蛋白基因的功能 　采用注射法在 Cf2 4转基因烟草的第 1和第 2叶上
分别接种已培养好的含各种 V IGS载体的农杆菌 GV3101, 其中 TRV∶00作为阴性对照 ; TRV∶RGL作
为阳性对照 (RGL在 V IGS试验中使 HR反应丧失 ) ; TRV∶RGL IP用来检测 RGL互作蛋白基因在 HR
反应中扮演的角色。接种后 3周在第 3、第 4和第 5片叶上以及接种后 5周在第 6和第 7片叶上分别
注射接种含双元表达载体 pRH78∶A vr 4的农杆菌 GV3101, 进行激发子 A vr 4的处理 , 处理后 3～5 d
观察 HR反应发生的情况。对于 RGL互作蛋白基因和对照都进行 3次重复试验。
2　结果与分析
211　参与 HR反应的基因的序列分析
对从番茄中筛选出的 5个参与 HR反应的基因进行了序列分析 , 发现其中 1个基因与许多抗病基
因如 P rf、B s2等同源 , 命名为 RGL基因。在 1～889个氨基酸序列上推测第 167～439个氨基酸 (下
划线显示 ) 为 NB 2ARC保守结构域 , 这是许多抗病基因所拥有的一种保守的信号转导结构域 (图 1) ,
因此选它作为酵母双杂交的诱饵蛋白。
图 1　RGL蛋白序列与推测的保守结构域 RGL (下划线部分 )
F ig. 1　Sequence and puta tive con served doma in of RGL ( Under lined)
212　酵母双杂交筛选互作蛋白基因与序列分析
酵母共转化后 , 共获得 100万个含双质粒的酵母克隆 , 经两轮 Try- / Leu - /Ade - / H is- 选择培
养基上筛选 , 获得了 43个候选阳性克隆 , 经自动激活检测筛选 , 最后获得了 3个阳性克隆 (图
版 , A、B )。
测序分析结果表明 , 其中有两个克隆完全相同 , 即获得了两个互作蛋白 , 分别命名为 RGL IP21和
RGL IP22。RGL IP21全长 291个氨基酸 (图 2) , 与叶绿体中 1种类囊体内腔蛋白有 63%的同源性 ;
RGL IP22全长 248个氨基酸 (图 3) , 与拟南芥转导素有 60%的同源性。
213　互作蛋白基因的功能验证
在 Cf24转基因烟草上用激发子 A vr 4处理后会诱导产生 HR反应 , 叶片接种部位在初期表现为大
面积的失水萎蔫 , 到后期出现枯死现象 , 而且接种空的病毒载体 TRV∶00也不会影响 HR的产生 (图
版 , C)。为了筛选参与 HR信号转导的基因 , 还设立了 1个阳性对照 TRV∶RGL , 通过 V IGS方法使它
沉默后导致了 HR反应的减弱 (图版 , D )。用同样的方法对 RGL互作蛋白的基因进行功能分析 , 结
果显示 RGL IP21基因沉默后导致了 HR反应的减弱与 TRV∶00相比有较弱的过敏性坏死现象 (图版 ,
E) , 而 RGL IP22基因沉默后使 HR反应完全丧失无过敏性坏死现象 (图版 , F)。
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图 2　用酵母双杂交方法从番茄 cD NA文库中分离的 RGL IP21核苷酸序列和推导的氨基酸序列
F ig. 2　Nucleotide sequence and deduced am ino2ac id sequence of RGL IP21 isola ted from toma to cD NA
library through yea st two2hybr id system
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图 3　用酵母双杂交方法从番茄 cD NA文库中分离的 RGL IP22核苷酸序列和推导的氨基酸序列
F ig. 3　Nucleotide sequence and deduced am ino2ac id sequence of RGL IP22 isola ted from toma to cD NA
library through yea st two2hybr id system
3　讨论
利用病毒诱导的基因沉默技术从番茄中筛选出 5个参与 HR反应的基因 , 对其中一个 RGL基因进
行了序列分析 , 发现它具有一个 NB 2ARC保守结构域 , 是许多抗病基因所拥有的一种保守的信号转导
结构域 , 因此推测 , 在番茄细胞中存在与该基因的编码蛋白互作的蛋白质。有趣的是在动物中研究发
现 , 这种功能结构域是一种细胞死亡的调节子〔10〕。
选用 RGL蛋白作为诱饵蛋白 , 采用酵母双杂交方法筛选与之互作的蛋白 , 结果获得了两个互作
蛋白。用 V IGS技术验证了两个互作蛋白都参与了 HR反应 , 序列分析表明 RGL IP21与叶绿体中的一
种类囊体内腔蛋白有 63%的同源性 , 已有研究表明叶绿体功能的迅速衰退会加速 HR的产生〔11〕, 因
此进一步证实了 HR反应与叶绿体紧密相关 : RGL与 RGL IP21互作后有可能导致叶绿体功能的迅速衰
退 , 从而加速了 HR反应的产生。以上结果还暗示了 NB 2ARC保守结构域在动植物体中有可能是专一
性地激活细胞死亡中关键的调控因子 , 使一些细胞器的功能迅速衰退 , 导致整个细胞死亡。与 RGL
互作的另一个蛋白 RGL IP22与拟南芥转导素有 60%的同源性。转导素也称为 G蛋白 , 活细胞体内的
G蛋白一般被分为两大类 , 一类是由 3种不同亚基 (α, β, γ) 构成的三聚体 G蛋白 , 另一类是只含
有 1个亚基的单聚体 G蛋白 , 故又被称为小 G蛋白。作为膜结合蛋白 , 它在细胞信号转导中起中介
作用 , 通过偶联细胞表面受体与其所调节的相应生理生化活动而参与多种细胞信号转导过程〔12～14〕。
目前已有试验证明 G蛋白介导了植物的抗病反应 , 但一般是小 G蛋白〔8, 15〕。RGL IP22蛋白属于哪一类
G蛋白尚需进一步研究。
本研究中的 RGL及与它互作的两个蛋白有可能存在于同一个信号转导支路上 , 也可能位于信号
转导的分支点上。本研究中 HR反应只是部分丧失 , 原因可能是在 V IGS试验操作过程中 , RGL基因
并没有发生有效的沉默 , 有少量的基因转录物剩余并翻译成相应的蛋白质 , 行使着 RGL基因的部分
功能。本研究只对番茄 cDNA文库一半的克隆 (该文库包含两百万个克隆 ) 进行了酵母双杂交的筛
选 , 若继续筛选番茄 cDNA文库的另一半克隆 , 相信还有可能会发现新的与 RGL互作的蛋白。
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图版说明 : A, B: 酵母双杂交的筛选 ; C～F: 互作蛋白的基因在 Cf24转基因烟草上的功能分析 　A. Try - / Leu - /Ade - / H is - 选择
培养基上的筛选 (箭头示候选阳性克隆 ) ; B. 自动激活检测 (上行为空的 BD质粒和 AD质粒共转化的酵母 ; 下行为诱饵质粒和 AD
质粒共转化的对照酵母 ) ; C. 阴性对照 ; D. 阳性对照 ; E和 F. RGL IP21和 RGL IP22。
Explana tion of pla tes: A, B: The screen result of yea st two2hybr id; C - F: Functiona l ana lysis of RGL IP genes using V IGS in Cf24
tran sgen ic N icotiana ben tham iana plan ts　A. Screen on Try - /Leu - /Ade - /H is - medium ( arrows indicate candidate clones) ; B. Autoacti2
vation test ( the upper three clones are the yeast with emp ty BD p lasm id and AD p lasm id; the lower three clones are the yeast with bait BD p lasm id
and corresponding AD p lasm id) ; C. Negative control; D. Positive control; E and F. RGL IP21 and RGL IP22.
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