全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (4) : 709～713
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 11 - 09; 修回日期 : 2006 - 02 - 14
基金项目 : 广东省攻关项目 (2002A2080101102; C20209)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jianli@ scau1edu1cn)。第一作者现在福建省农业科学院果树研究所工作。
香蕉茎尖滴冻法保存中细胞的超微结构变化
张守梅 1 　李建国 1, 23 　陈厚彬 1 　徐春香 1 　韩丽娜 1
(1 华南农业大学热带亚热带果树研究室 , 广东广州 510642; 2 华南农业大学园艺生物技术研究所 , 广东广州 510640)
摘 　要 : 应用透射电镜研究了香蕉茎尖滴冻法超低温保存中细胞超微结构的变化规律。结果表明 : 装
载后 , 细胞液泡化程度降低 , 出现质壁分离。脱水处理使质壁分离程度加重 , 原生质体浓缩 , 一部分细胞
的细胞壁、膜系统发生了不可逆的损伤 ; 也有小部分位于分生组织区域的细胞结构虽然发生了变化 , 但程
度不深 , 在恢复培养时会自动修复 , 并再生出植株。细胞严重伤害主要发生在脱水处理过程中 , 冷冻环节
基本上不产生新的损伤。讨论了上述变化的可能机制。
关键词 : 香蕉 ; 超低温保存 ; 滴冻法 ; 超微结构
中图分类号 : S 66811　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0420709205
Ultrastructura l Changes A ssoc ia ted w ith Droplet Vitr if ica tion Cryopreserva tion
of Banana Shoot2tip
Zhang Shoumei1 , L i J ianguo1, 23 , Chen Houbin1 , Xu Chunxiang1 , and Han L ina1
(1 Tropica l and Subtropica l Labora tory, Sou th China A gricultural U niversity, Guangzhou, Guangdong 510642, China; 2 Institu te
of B iotechnology on Horticultural C rop, South China A gricultural U niversity, Guangzhou, Guangdong 510640, China)
Abstract: U ltrastructure of banana shoot2tip cells during drop let vitrification cryop reservation was ob2
served by using the transm ission electron m icroscopy ( TEM ). The results showed that loading decreased the
degree of vacuolation and caused p lasmolysis. The extent of p lasmolysis became more severe and p rotop last
was condensed after dehydrating treatment. Meanwhile, cell walls, cell membranes and nucleus envelopes of
some cells were lethally injured. A lthough there were some changes in the structure of many other cells, the
damage was reversible, which m ight be rehabilitated automatically during recovery culture and regenerating
p lantlets could be obtained. Cells were mainly damaged during the dehydrating p rocess, and no significant al2
terations occurred subsequently in the cooling step. The possible mechanism s for those results were discussed.
Key words: Banana; Cryop reservation; D rop let vitrification; U ltrastructrue
香蕉 (M usa spp. ) 是营养繁殖作物 , 种质离体保存尤为重要。近几年发展较快的玻璃化法超低温
保存具有设备要求简单、材料处理步骤简便、效果和重演性好等优点〔1, 2〕, 成为较理想的植物种质资源
保存方法。滴冻法是在玻璃化法的基础上发展而来 , Agrawal等〔3〕比较了几种超低温方法保存香蕉茎尖
的效果 , 发现滴冻法保存的成活率更高 , 适用范围更广。我们采用滴冻法成功保存了分属于 5个基因组
型的 15份蕉类资源 , 平均成活率分别为 : AAA 7810% , AAB 5718% , ABB 7211% , AA 4313% , Itiner2
ans 4212%〔4〕。目前对于超低温保存过程中细胞超微结构变化的报道还很少 , 仅见于糜子〔5〕、红豆草〔6〕
悬浮细胞超低温保存、水稻胚性悬浮细胞〔7, 8〕、香蕉分生组织块〔9, 10〕和番木瓜茎尖〔11〕玻璃化保存等。
本研究的目的是利用透射电镜技术观察香蕉茎尖在装载、脱水、冷冻和恢复等滴冻法超低温保存
全过程中细胞超微结构的变化 , 以期为进一步完善超低温保存技术 , 制定合理的保存方案提供重要的
依据 , 并对了解超低温保存中细胞冷冻损伤和冷冻保护的机制有一定的参考价值。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
1　材料与方法
111　植物材料
供试材料取自华南农业大学香蕉离体保存库 , 品种为巴西蕉 (M usa spp. AAA group )。取 2～3
cm高的试管苗在 MS + 012 mol/L蔗糖的培养基上生根 , 一个月后选取粗壮的生根苗剥取茎尖进行超
低温保存。其基本过程 : 解剖镜下剥取含有 1～2个叶原基的茎尖 , 长 115～215 mm, 先在室温下用
装载液 LS (MS + 2 mol/L甘油 + 014 mol/L蔗糖 ) 预处理 20～120 m in, 再用玻璃化溶液 PVS2 (MS +
30%甘油 + 15%乙二醇 + 15%二甲基亚砜 + 014 mol/L蔗糖 ) 于 0℃下处理 30～50 m in, 接着将 PVS2
溶液滴于铝箔上 , 每个液滴中放一个茎尖 , 迅速投入液氮。保存 1 h后 , 将铝箔取出投入卸载液
(MS + 112 mol/L蔗糖 ) 中快速解冻。15 m in后取出茎尖 , 用滤纸吸去水分 , 转入过渡培养基上 (MS
+ 013 mol/L蔗糖 ) 暗培养 24 h。再转到恢复培养基上 , 暗培养一周后转移到光下常规培养。
透射电镜制样时取以下样品 : (1) 正常生长的茎尖 (对照 ) ; (2) 在 LS中预处理的茎尖 ; (3)
在 PVS2中脱水后的茎尖 ; (4) 经预处理和脱水后直接卸载的茎尖 ; (5) 在液氮中保存 1 h后迅速解
冻的茎尖 ; (6) 恢复生长 7 d后的茎尖。
112　超微结构的观察
透射电镜制片和观察参照曾继吾〔12〕和 Helliot等〔10〕的方法 , 把处理后的茎尖 , 立即投入 3%戊二
醛溶液中固定 , 用针筒抽气真空渗透处理 , 4℃冰箱贮放。然后进行超薄切片制备 : (1) 经前固定的
样品用 pH 710的磷酸缓冲液洗涤 6次 , 共 2 h; (2) 用 1%的锇酸进行后固定 3 h, 再用磷酸缓冲液
洗涤 6次 , 共 1 h; (3) 用 50% , 70% , 80% , 90%和 100%的乙醇进行逐级脱水 ; (4) 用环氧树脂
Epon812包埋渗透 ; (5) 将胶囊放入烘箱使包埋块聚合 ; (6) 用锋利刀片将包埋块修整成顶部锥状 ,
显出样品 ; (7) 将修理好的样品装在超薄切片机上切片 ; (8) 用 2%醋酸铀对超薄切片进行染色。
最后 , 在透射电子显微镜 ( Philip s EM400) 下观察茎尖细胞的超微结构并拍照。
2　结果
211　正常生长生根苗的茎尖细胞超微结构
培养在 MS + 012 mol/L蔗糖生根培养基上的香蕉苗 , 生长旺盛 , 假茎粗壮 , 有较高浓度蔗糖的同
时又有一定的预培养效果。生长点细胞的超微结构特征是 : 原分生组织区液泡小、胞质浓、细胞核
大 ; 髓分生组织区液泡大 , 细胞体积增大 (图版 , 1) ; 细胞结合紧密 , 间隙小 ; 核质中有分散的染
色质 , 在细胞核中有一个染色较深的核仁 , 核膜规则 , 同时可见质膜平滑 , 紧贴细胞壁 , 双层膜结构
清晰可见 ; 出现了比较多的淀粉粒 , 核质比高 (图版 , 2) ; 能看到大量细胞器 , 如线粒体、叶绿体、
质体、内质网等 (图版 , 3)。
212　装载液处理后的细胞超微结构
装载液处理后 , 细胞间隙变大 , 细胞结构保持完好 , 双层核膜清晰可见。但是 , 淀粉粒消失 , 细
胞质变浓 , 发生了轻微的质壁分离。中央大液泡在轻微脱水的过程中变小 , 从细胞中看到的是一系列
的小液泡。由于渗透势的改变 , 使膜受伤害 , 一些物质流到质壁分离的空腔内 (图版 , 4、5)。
213　在 PVS2溶液中脱水后的细胞超微结构
经过 PVS2处理后 , 细胞进一步脱水 , 在细胞中基本上不能找到大液泡。有的细胞发生严重质壁
分离 , 细胞质与细胞壁之间出现了比较大的空腔 , 内有大量纤维状物 (图版 , 6、7)。原生质体浓
缩、断缢、解体 , 质膜仍清晰 (图版 , 6)。细胞核轮廓模糊、解体 , 核仁不清晰。质体膨大 ; 线粒
体膨胀 , 内部小泡化 ; 有的液泡膜解体 (图版 , 7)。
214　经预处理和脱水后直接卸载的细胞超微结构
用含高浓度蔗糖的卸载液进行洗涤 , 除去了有毒性作用的保护剂。大部分细胞结构与洗涤前相比
017
　4期 张守梅等 : 香蕉茎尖滴冻法保存中细胞的超微结构变化 　
无明显变化 , 由于 PVS2导致细胞严重脱水 , 质壁分离未能很快恢复 (图版 , 8)。少数细胞内部进一
步解体 , 沉淀减少 , 但细胞质中有完整的淀粉粒出现 (图版 , 9)。
215　在液氮中保存 1 h后的细胞超微结构
液氮保存后 , 细胞的超微结构与脱水处理后相差不大 (图版 , 10)。质壁分离严重 , 原生质体浓
缩 , 细胞内含物分解 , 液泡内部和周围都产生了沉淀 (图版 , 10、11)。核仁分散 , 核池区域膨胀 ,
染色质不规则分散 , 液泡内折形成吞噬小泡 (图版 , 12) , 细胞器被严重破坏 , 只有淀粉粒仍然是完
整的 , 说明在整个处理过程中质体的破坏最小 (图版 , 11)。
216　恢复生长 1周后的细胞超微结构
经过液氮保存后的茎尖在恢复生长 1周后 , 细胞结构基本与对照相似。质壁分离复原 , 由脱水引
起的核周隙扩张和膜性物质小泡化也被修复 , 出现中央大液泡 , 细胞器恢复成形 (图版 , 13) , 可看
到前质体 , 前质体中小黑点为嗜锇颗粒 (图版 , 14)。
3　讨论
利用冰冻保护剂进行脱水处理是滴冻法超低温保存中的关键环节 , 细胞只有脱去足够的水 , 才能
在快速冷冻时进入玻璃化态而减少冰晶形成 , 但脱水又会给细胞带来损伤。细胞的超微结构虽然在装
载这一步就开始发生变化 , 如出现了质壁分离现象 , 但这可能只是细胞自我保护的一种适应性反应 ,
通过原生质收缩提高细胞液浓度 , 从而提高细胞的抗寒力。只有经过冰冻保护剂处理后 , 细胞质壁分
离、核周隙扩张和膜性物质小泡化现象明显 , 细胞膜和一些细胞器甚至受到致命伤害。但也有一些细
胞经过保护剂处理后 , 抗冻性提高 , 表现在细胞结构上只有轻微变形 , 并未造成细胞器和膜结构的明
显破坏 , 从恢复培养 7 d后的细胞结构来看 , 这种伤害大多是可逆的 , 适宜培养条件下可以恢复。观
察还发现 , 冷冻后细胞的超微结构基本上与脱水后相同 , 只是在有些细胞中程度有所加重 , 如原生质
体严重收缩 , 各种细胞器及膜结构普遍遭到破坏等。因此 , 从细胞的超微结构上看 , 细胞变化最大是
在脱水处理过程中 , 冷冻这一环节基本上没有产生新的细胞损伤 , 这与滴冻法保存的预期效果及本质
机理是一致的。刘峰等〔7〕和 W ang等〔8〕用透射电镜观察了水稻胚性悬浮细胞玻璃化保存中的超微结构
变化也得到了相似的结论。
然而 , Helliot等〔9, 10〕认为香蕉分生组织块在玻璃化法超低温保存中细胞的损伤主要发生在脱水、
冷冻或解冻环节。曾继吾等〔11〕在番木瓜茎尖超低温保存过程中的细胞超微结构观察时也发现了类似
规律。滴冻法本质上也是玻璃化法 , 但在冷冻或解冻环节没有发现新的细胞伤害 , 这可能与滴冻法的
降温、复温速度非常快有关。由于茎尖比单个细胞含水量大 , 在玻璃化法冷冻过程中降温速度不够快
仍会有冰晶形成 , 而滴冻法的降温、复温速度比玻璃化法快 20多倍 , 能使细胞迅速进入玻璃化态从
而减少损伤 , 由此可以推论滴冻法可以获得比玻璃化法更高的成活率。实践上也确实如此 , 同一品种
‘巴西 ’, 滴冻法保存的茎尖成活率为 6715% , 而玻璃化法只有 1313%〔4〕。
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　4期 张守梅等 : 香蕉茎尖滴冻法保存中细胞的超微结构变化 　
图版说明 : 液氮保存前香蕉茎尖的超微结构 (1～9)。1～3. 正常生根苗茎尖的超微结构 (对照 ) (1. 分裂旺盛的生长点细胞 , 有比
较大的液泡 ; 2. 示大量的造粉体及淀粉粒 ; 3. 示线粒体、前质体、内质网 )。4, 5. 装载处理后香蕉茎尖的超微结构 ( 4. 细胞中的
液泡体积变小 , 发生轻微质壁分离 ; 5. 细胞发生轻微质壁分离 )。6, 7. 用 PVS2脱水处理后香蕉茎尖的超微结构 (6. 产生严重质壁
分离 , 细胞质浓缩断裂 , 核膜模糊 ; 7. 质膜部分发生变形 , 有的液泡膜解体 )。8, 9. 经装载及脱水后直接卸载 (未经冷冻 ) 的细
胞结构 (8. 未能修复 PVS2造成的的细胞损伤 , 严重的质壁分离 ; 9. 细胞结构进一步解体 , 但出现了淀粉粒 )。液氮保存 1 h后香蕉
茎尖的超微结构 (10～14)。10～12. 液氮保存 1 h后香蕉茎尖的超微结构 (10. 发生轻微质壁分离 , 损伤小的细胞 ; 11. 发生严重质
壁分离 , 损伤严重的细胞 ; 12. 核池区域膨胀 , 液泡内折形成吞噬小泡 )。13, 14. 超低温保存后 , 恢复培养 1周的细胞超微结构
(13. 细胞恢复生长 , 结构似对照 ; 14. 大量的前质体和噬锇颗粒等细胞器 )。W. 细胞壁 ; Cy. 细胞质 ; Pl. 质膜 ; N. 细胞核 ;
Ncs. 核周隙 ; Ne. 核膜 ; Nu. 核仁 ; V. 液泡 ; A. 造粉体 ; S. 淀粉粒 ; M. 线粒体 ; ER: 内质网 ; P. 前质体。
Explan ta tion of pla tes: U ltrastructure of banana shoot2tip before cryop reservation (1 - 9) . 1 - 3. U ltrastructure of banana shoot2tip (Control)
(1. Control cell with a large vacuole; 2. Amylop last containing starch grain; 3. M itochondria, p rop lastids and rough endop lasm ic reticulum).
4, 5. U ltrastructure of banana shoot2tip after loading (4. Fragmentation of vacuoles into smaller ones and m ild p lasmolysis; 5. M ild p lasmoly2
sis) . 6, 7. U ltrastructure of banana shoot2tip after dehydrating with PVS2 (6. Severe p lasmolysis and disrup tion of cytop lasm and nuclear enve2
lope; 7. D isrup tion of p lasmalemma and vacuole envelope) . 8, 9. U ltrastructure of banana shoot2tip after loading and dehydrating with PVS2,
then unloaded (8. Severe p lasmolysis; 9. The ultrastructure of lethal injury cell with only contact starch grains) . U ltrastructure of banana shoot2
tip cooled in LN and held there for 1 h and subsequently warmed ( 10 - 14) . 10 - 12. U ltrastructure of banana shoot2tip after cryop reservation
(10. M ild p lasmolysis and m inor injury; 11. Severe p lasmolysis; 12. Irregular extension of the nuclear envelope) . 13, 14. U ltrastructure of
banana shoot2tip after 7 days of recovery culture ( 13. Surviving cells; 14. Numerous organelles such as p rop lastid and osm iophilic globules) .
W. Cell wall; Cy. Cytosol; Pl. Plasmalemma; N. Nucleus; Ncs. Nucleus cisternal space; Ne. Nucleus envelope; Nu. Nucleolus; V. Vacu2
ole; A. Amylop last; S. Starch grain; M. M itochondrion; ER. Endop lasm ic reticulum; P. Prop lastid.
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