全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 489 - 492
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 11 - 28; 修回日期 : 2007 - 02 - 08
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30370987) ; 江苏省应用基础项目 (BJ200018)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: Zhangzhen_nj@ hotmail1com)
农杆菌介导菜豆铁结合蛋白基因 ( PvF er) 转化番
茄的研究
叶　霞 1, 2 , 黄晓德 1 , 姚泉洪 3 , 章　镇 13
(1 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095; 2 河南黄河园林绿化工程有限公司 , 郑州 450003; 3 上海市农业遗传重点试
验室 , 上海 201106)
摘 　要 : 利用农杆菌介导的转化方法将菜豆铁结合蛋白基因 ( PvFer) 导入 ‘粉红 908’番茄基因组
中。经 PCR、PCR2Southern、Southern blotting检测证实 , 外源基因已整合到 2株番茄基因组中。半定量式
RT2PCR检测表明 , 外源菜豆铁结合蛋白基因在 2株转基因植株中得到了表达。测定番茄果实和叶片中铁、
锌、锰含量表明 , 转 ferritin基因株系 T1的叶片铁含量提高了 174% , 果实中的铁含量提高了 37% , 锌在果
实中提高了 119% , 而锰在果实中的含量却降低了 56%。
关键词 : 番茄 ; 铁蛋白基因 ; 根癌农杆菌 ; 转化
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220489204
A grobac te rium 2m ed ia ted Tran sforma tion of Toma to w ith PvF er
YE Xia1, 2 , HUANG Xiao2de1 , YAO Quan2hong3 , and ZHANG Zhen13
(1 College of Horticulture, N an jing A gricultural U niversity, N an jing 210095, Ch ina; 2 Henan Yellow R iver Garden ing L im ited Com 2
pany, Zhengzhou 450003, China; 3 Shanghai Key L abora tory of A gricu ltura l Genetic and B reed ing, Shangha i 201106, Ch ina)
Abstract: In this study, the bean iron2binding p rotein gene ( PvFer) was introduced into the genome of
tomato Fenhong 908 by A grobacterium 2mediated genetic transformation. The results of PCR, PCR2Southern
and Southern blotting analysis confirmed that foreign ferritin gene was integrated into the genome of two tomato
p lants. RT2PCR revealed that the foreign ferritin gene was exp ressed in the two tomato p lants. Measurement of
Fe, Zn, Mn contents in fruits and leaf of the transgenic tomato p lants suggested that iron content in leaves of
T1 transgenic line was app roximately 217 times that of the non2transformed leaves, and iron content in fruits
was increased by 37% ; zinc content in fruits was increased by 119% , but manganese content in fruits of T1
transgenic line was decreased by 56%.
Key words: Tomato; ferritin; A g robacterium tum efaciens; Transformation
已有研究认为 , 植物性食品中铁含量较低不是因为土壤环境中缺少铁 , 而与植物对铁的吸收与贮藏
能力有关。铁结合蛋白在调节植物铁含量中起了很重要的作用 (B riat, 1996) , 将铁结合蛋白基因导入
番茄基因组中 , 可通过其在果实中的特异表达增加果实中铁元素的含量 , 提高番茄的营养价值。
1　材料与方法
本试验拟将菜豆铁结合蛋白基因 ( PvFer) (登录号为 P25699) 导入 ‘粉红 908’番茄基因组中。
所用的根癌农杆菌为携带表达载体质粒 pAP160菌株 LBA4404。质粒 pAP160包含筛选标记基因卡那
霉素基因和 GUS报告基因。目的基因菜豆铁蛋白基因由 2A11果实特异表达启动子控制 (图 1)。
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
图 1　质粒 pAP160的图谱
ferritin: 铁结合蛋白基因 ; 2A11: 果实特异表达启动子 ; SAR: 核骨架附着区 DNA片段 ;
GUS: 葡萄糖苷酸酶基因 ; Km : 卡那霉素基因。
F ig. 1　A map of pAP160
ferritin: Iron2binding p rotein gene; 2A11: Fruit special exp ressing p romoter; SAR: Scaffold attachment regions;
GUS: Theβ2glucoronidase gene; Km : Kanamycin gene.
将番茄种子在 70%的乙醇中浸泡 1 m in, 然后在 1%的 NaClO溶液中消毒 30 m in, 再用无菌水冲
洗干净 , 接种在 1 /2MS培养基上。用生长 7 d的实生苗子叶进行转化试验。
将含有质粒 pAP160的农杆菌接种于附加 10 mg/L Cm (氯霉素 ) 和 50 mg/L R if (利福平 ) 的
YEB培养基中 , 28℃振荡过夜 (OD = 013左右 ) , 离心后用 MSO (无激素的 MS培养液 ) 培养液重悬
沉淀。用农杆菌浸染番茄的子叶切片 3 m in, 然后将子叶置于共培养培养基 (MS + ZT 110 mg/L + IAA
110 mg/L + Km 50 mg/L) 上 , 3 d后转移到筛选培养基 (MS + ZT 110 mg/L + IAA 110 mg/L + Km 50
mg/L + Cb 250 mg/ L) 上进行两周的暗培养 , 4周后统计分化率。
取番茄试管苗的幼叶 , 分别提取其基因组的 DNA和 RNA , 进行 PCR扩增和 RT2PCR试验。扩增
引物为 : 5′CAGGATCCAATGGCCCTCCGCTCCTTCTAAAG3′和 5′CAGAGCTCAAGCGGCATG TCCATCAT2
GAA3′。PCR2Southern、Southern blotting试验均采用 Roche公司的 “D IG H igh Prime DNA Labelling and
Detection Starter Kit I”地高辛标记试剂盒的方法进行。半定量 RT2PCR试验参照 Promega公司的 M 2
MLV反转录酶的说明进行。
取在温室中正常生长的转基因和非转基因盆栽番茄植株的叶片、果实 , 用蒸馏水冲洗干净 , 吸干
表面水分 , 120℃烘箱中烘烤 15 m in后 , 80℃烘烤过夜 , 称干质量 , 然后放在电炉上充分炭化 , 放入
马福炉中 , 500℃灰化 4 h。冷却后 , 用少量水润湿灰分 , 小心加入 1 mL 1∶1的 HCl溶解 , 加水定容
至 10 mL, 用原子吸收分光光度法测定其中铁、锰、锌的含量。每处理 5株 , 3次重复。
2　结果与分析
211　转 fe rritin基因番茄植株的获得
用含有 ferritin基因的农杆菌 LBA4404菌株对番茄进行叶盘法转化 , 然后转到添加 250 mg/L羧苄
和 50 mg/L卡那霉素的分化培养基上 2～3周 , 约有 30%的外植体长出绿色的愈伤组织 ; 继代培养 3
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　2期 叶 　霞等 : 农杆菌介导菜豆铁结合蛋白基因 ( PvFer) 转化番茄的研究 　
～6周后 , 分化出不定芽 , 转入含 100 mg/L卡那
霉素的生根培养基中进一步筛选。本试验共获得
5株长势良好的抗 Km阳性苗 (图 2) , 有 2株经
GUS基因检测表现为阳性。
212　PCR检测结果
图 3显示 , 2株 GUS阳性植株与质粒一样均扩
增出大小相同的目的条带 , 与外源 PvFer的大小
(764 bp) 相近 , 而非转基因对照未扩增出任何条
带 , 这表明外源基因可能已整合到番茄基因组中。 图 2　番茄的抗性植株
F ig. 2　Kanam yc in2resistan t toma to plan t213　PCR2Southern blotting检测结果
PCR2Southern blotting检测结果显示 : 转基因株系 1、2和未经过酶切的质粒均出现了杂交条带 ,
而对照植株没有杂交带出现 (图 4) , 表明转基因番茄基因组中整合的是 pAP160载体所携带的 PvFer。
图 3　番茄 GUS阳性植株的 PCR检测
M: 分子量标记 ; P: 质粒 ; CK: 非转化植株 ; 1, 2: 转化植株。
F ig. 3　PCR ana lysis of the GU S2positive toma to plan ts
M: Marker; P: Plasm id; CK: Non2transgenic p lants;
1, 2: Transgenic p lants.
图 4　番茄 GUS阳性植株 PCR2Southern杂交检测
CK: 非转化植株 ; 1, 2: 转化植株 ; P: 质粒。
F ig. 4　PCR2Southern blotting of the GUS 2positive toma to plan ts
CK: Non2transgenic p lants;
1, 2: Transgenic p lants; P: Plasm id.
214　Southern blotting检测结果
基因组经单酶切后杂交结果显示 (图 5) , 转
基因株系 1、2和经过酶切后的质粒均具有清晰的
杂交条带 , 信号较强 , 且只出现一条单带 , 表明
外源菜豆 ferritin基因在转基因番茄株系 1和 2基
因组中已经插入 , 并且至少有 1个拷贝 ; 在转基
因番茄株系 1和株系 2之间的杂交信号出现在不
同的位置 , 说明外源基因在基因组内整合的位点
不同。
215　RT2PCR检测结果
用 RT2PCR方法对 Southern杂交阳性的转基
因番茄试管苗的表达分析 (图 6) 表明 , 2株番
茄转基因试管苗的 RNA经反转录后均扩增出与
PvFer的大小相近的 DNA片段 , 而阴性对照没有
条带。这表明在果实特异表达启动子控制下的外
源菜豆铁蛋白基因已在番茄植株的茎叶中得到了
表达 , 此结果与 van Haaren和 Houck ( 1991) 报
道的 GUS基因在 2A11启动子控制下的表达结果
图 5　转基因番茄的 Southern杂交检测
P: 质粒 ; 1, 2: 转基因植株。
F ig. 5　Southern blotting of the tran sgen ic toma to plan ts
P: Plasm id; 1, 2: Transgenic p lants.
图 6　转基因番茄的 RT2PCR检测
M: DNA分子量 Marker; CK: 非转化植株 ; 1, 2: 转化植株。
F ig. 6　RT2PCR ana lysis of the tran sgen ic toma to plan ts
M: Marker; CK: Non2transgenic p lants; 1, 2: Transgenic p lants.
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
是一致的。
216　转基因番茄组织中铁、锌、锰含量的变化
表 1结果显示 , 番茄转基因株系 T1与对照相比 , 果实中的铁含量提高了 37% , 锌含量提高了
119% , 叶片中的铁含量增加了 174%。这因为 2A11启动子是非特异性的果实特异表达启动子。娄晓
鸣等 (2005) 在转化乙肝表面抗原大蛋白基因到苹果基因组中也发现了类似的现象。但是 , 与对照
相比 , 果实中锰的含量下降了 56% , 而叶片中锰的含量却又增加了 65%。
表 1　转基因番茄组织中铁、锌、锰的含量
Table 1　Fe, Zn, M n con ten t in d ifferen t tissues of the tran sgen ic and con trol toma to plan ts (μg/g DM)
株系
Individual
Fe
果实 Fruit 叶 Leaf
Zn
果实 Fruit 叶 Leaf
Mn
果实 Fruit 叶 Leaf
T1 410150a 286174a 121166a 105169a 72165b 23178a
T2 216175c 138195b 93109a 68161b 49181b 22126a
NT 300144b 104134c 55138b 94168a 166106a 14139a
　　注 : NT, 非转基因植株对照 ; 同列数值不同字母表示差异达 5%显著水平。
Note: NT, non2transgenetic individual as control; D ifferent letters within the same column indicate significant difference at 5% level.
T2株系果实和叶片锰的含量和 T1株系的变化规律一致 , 果实中锰的含量比对照降低了 70% , 叶
片中锰的含量略有增加。但是 , 从番茄转基因株系 T2的铁含量来看 , 番茄果实中铁含量不但没有增
加 , 还比对照植株下降了 28%。
而 PCR、PCR2Southern、Southern blotting分子检测试验证实外源 PvFer已完全插入到番茄基因组
中 , RT2PCR试验也表明外源基因在番茄体内有转录 ; 同时 , Southern杂交显示外源铁蛋白基因在番
茄转基因植株 T1和 T2基因组内均是单拷贝插入 , 只是在插入位点上有差异。究竟是何种原因造成外
源基因在转基因植株体内发生转录后沉默 , 有待进一步研究。
锰的生物化学性质与铁相似 , 所以当铁大量积累时 , 锰的含量将会下降 ( Goto et al. , 2000)。本
研究显示番茄 T1转基因株系的果实中铁的含量增加了 37% , 而锰的含量却降了 56%。 Goto等
(2000) 在莴苣的转铁蛋白基因植株中也发现个别株系有类似的结果 , 但大部分转铁蛋白基因的植株
中不但铁含量大幅度提高 , 而且锰的含量也有所增加。
在本试验的番茄转基因叶片中也发现铁含量的增加并未影响锰的积累 , 究竟是何原因造成叶片和
果实中铁、锰积累的差别有待进一步研究。
References
B riat J F. 1996. Roles of ferritin in p lants. Journal Plant Nutrition, 19 (89) : 1331 - 1342.
Goto F, Yoshihara T, Saiki H. 2000. Iron accumulation and enhanced growth in transgenic lettuce p lants exp ressing the iron2binding p rotein fer2
ritin. Theor. App l. Genet. , 100: 658 - 664.
Lou Xiao2m ing, Zhang Zhen, Yao Quan2hong, Xiong A i2sheng, W ang Hua2kun, Peng R i2he, L i Xian. 2005. Exp ression of human hepatitisB vi2
rus large surface antigen gene PRS 2S1S2S in transgenic app les. Journal of Fruit Science, 22 (6) : 601 - 605. ( in Chinese)
娄晓鸣 , 章　镇 , 姚泉洪 , 熊爱生 , 王化坤 , 彭日荷 , 李　贤. 2005. 乙肝表面抗原大蛋白基因 (S1S2S ) 在转基因苹果中表达.
果树学报 , 22 (6) : 601 - 605.
van Haaren M, Houck C M. 1991. Strong negative and positive regulatory elements contribute to the high2level fruit2specific exp ression of the to2
mato 2A11 gene. PlantMolecular B iology, 17: 615 - 630.
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