全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 205 - 208
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 05 - 31; 修回日期 : 2006 - 09 - 08
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30471191) ; 山东省良种产业化课题 ; 山东农业大学博士基金项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hqw1215@ sohu1com)
甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因 cDNA片段的克隆及
表达分析
于喜艳 1 , 樊继德 1 , 何启伟 23
(1 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 山东泰安 271018; 2 山东省农业科学院蔬菜所 , 济南 250100)
摘 　要 : 根据在 GenBank中登录的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物 , 采用
RT2PCR方法从甜瓜花后 25 d的果实总 RNA中扩增出目标 cDNA片段 , 克隆到 pMD182T载体中。序列分析
表明 , 该片段与番茄蔗糖磷酸合成酶氨基酸序列同源性为 9819% , GenBank中登记号为 DQ355797。通过
Northern blot检测其在甜瓜果实不同发育时期的表达变化 , 结果表明该基因在甜瓜果实花后 25 d开始表达 ,
随着果实的成熟 , 表达量升高。
关键词 : 甜瓜 ; 蔗糖磷酸合成酶基因 ; 克隆 ; 基因表达
中图分类号 : S 652　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120205204
C lon ing and Expression Ana lysis of a Sucrose Phospha te Syn tha se cD NA
Fragm en t in M elon Fru it
YU Xi2yan1 , FAN J i2de1 , and HE Q i2wei23
( 1 College of Horticu ltura l Science and Engineering, Shandong A gricultural U niversity, Ta ipian, Shandong 271018, China;
2V egetable Institu te, Shandong A cadem y of A gricu ltura l Science, J ipinan 250100, China)
Abstract: PCR p rimers were designed based on the conserved domain of some sucrose phosphate syn2
thase genes in GenBank. The target cDNA fragment was amp lified from the total RNA isolated from melon fruit
of 25 days after pollination with RT2PCR and then was cloned into pMD182T vector. The sequence showed that
the am ino acid sequence encoded by this fragment showed a 9819% sim ilarity to that of the corresponding re2
gion of sucrose phosphate synthase gene in tomato. The accession number of this gene in GenBank was
DQ355797. Northern blotwas performed to analyze the exp ression pattern of sucrose phosphate synthase in dif2
ferent development stages of melon fruit. The result showed that sucrose phosphate synthase began to exp ress
in fruit 25 days after pollination and the exp ression level of this gene increased with melon fruit mature.
Key words: Melon; Sucrose phosphate synthase gene; Cloning; Gene exp ression
甜瓜 (Cucum is m elo L. ) 以其甘甜而独特的风味被视为果品中的珍品 , 是重要的园艺作物之一。
甜瓜的品质主要决定于可溶性糖的含量和种类。据分析 , 成熟甜瓜中大于 97%的可溶性固形物是可
溶性糖 , 而蔗糖占 60%左右 (张明方 等 , 1998)。
已有不少研究表明 : 甜瓜含糖量的高低主要决定于果实发育后期酸性转化酶活性的下降幅度和蔗
糖磷酸合成酶活性的提高程度 ( Sarahe & James, 1987; Mc Collum & Hubert, 1988; Natalie & Steven,
1989)。蔗糖磷酸合成酶 ( Sucrose phosphate synthase, SPS EC 21411114) 是一种可溶性酶 , 活性最适
pH值约为 710, 存在于细胞质中。目前对该酶在甜瓜果实糖积累过程中的动态变化等已经研究得十
分清楚 , 但是对甜瓜 SPS的分子生物学研究报道却很少。我们已经克隆了甜瓜果实的酸性转化酶基
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因 , 并进行了对甜瓜的遗传转化研究 (于喜艳 等 , 2003)。本研究克隆了甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶
基因 cDNA片段并进行了表达研究 , 为更好的调节其在甜瓜果实中的表达 , 改善甜瓜品质提供依据和
手段。
1　材料与方法
111　材料
甜瓜自交系 ‘0123’于 2005年 2月 21日育苗 , 3月 25日定植于山东农业大学园艺站日光温室。
开花期进行人工授粉 , 严格控制自交。其它措施按一般生产。
112　总 RNA的提取
以开花后 25 d果实为材料 , 提取总 RNA。提取 RNA采用异硫氰酸胍 ( GTC) —酸性酚 —氯仿抽
提法。
113　SPS基因的克隆
根据在 GenBank中登录的番茄、马铃薯等作物的蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列 , 设计基因特
异引物 GSP1 为 5′2TCCAAGGAAGCCTATGA23′, GSP2 为 5′2AACAGCGTGACAACGAAGT23′。按 RNA
PCR (AMV ) Ver1211 Kit ( TaKaRa) 说明书 , 逆转录 : 取 1μL (约 1μg) 甜瓜果实总 RNA于 815μL
无 RNA酶的无菌双蒸水中 , 70℃水浴 10 m in, 立即置冰上 2 m in后 , 加入 25 mmol/L MgCl2 4μL, 10
×RNA PCR buffer 2μL, 10 mmol/L的 dNTP 2μL, RNase Inhibitor 015μL, Reverse Transcrip tase 1μL
(5 U /L) 和 oligo ( dT) 2Adap tor p rimer 1μL, 置 PCR仪中 , 反应条件为 42℃ 30 m in, 99℃ 5 m in,
5℃ 5 m in。
逆转录完成后 , 向反应体系中加入下列成分 : 25 mmol/L MgCl2 6μL, 10 ×RNA PCR buffer 8μL,
d1d1w 5715μL, 引物 GSP1 4μL (20 pmol/μL) , 引物 GSP2 4μL (20 pmol/μL ) , TaKaRa LA Taq酶
015μL (5 U /μL) , 总体积 100μL。 PCR反应参数为 94℃预变性 5 m in, 随后 94℃ 1 m in, 53℃ 1
m in, 72℃ 2 m in, 30个循环后 , 72℃再延伸 10 m in。PCR产物纯化后直接与 pMD182T ( TaKaRa) 载
体连接 , 采用热激法转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞。取 100μL菌液涂布于含 X2gal和 IPTG的筛选
培养基 (含氨苄青霉素 ) 平板 , 37℃培养 16 h后随机挑取白色菌落接种于加有 Amp (氨苄青霉素 )
50 mg/L的 LB液体培养基中 , 37℃过夜培养。按碱裂解法少量提取质粒。以质粒 DNA为模板进行
PCR鉴定 , 委托英俊生物技术有限公司测定 DNA序列。利用 DNAman、DNAclub软件及 NCB I网站进
行序列分析。
114　不同发育时期 SPS基因的表达
分别提取甜瓜果实花后 5、10、15、20、25 d和成熟果实的总 RNA , 将各时期甜瓜果实总 RNA
10μL (约 10μg) 与 115倍体积量的上样缓冲液混匀 , 点样至甲醛变性胶 , 40 V电压电泳 2 h。采取
毛细转移法将 RNA转移到尼龙膜上进行杂交。杂交探针 SPS cDNA片段采用地高辛标记方法 , 所有
操作严格按照 D IG Northern Starter Kit (Roche) 说明书提供方法进行。
2　结果分析与讨论
211　甜瓜果实 SPS基因 cD NA片段的克隆及序列分析
甜瓜果实花后 30 d左右 , 蔗糖磷酸合成酶活性最高 ( Sarahe & James, 1987; Natalie & Steven,
1989; 张明方 等 , 1998) , 但编码蛋白的 mRNA的高峰期应早于酶的活性期 , 所以取花后 25 d的果
实提取 RNA。甜瓜自交系 0123是我们多年选育的纯合材料 , 之所以将其作为试材克隆 S PS基因 , 是
因为下一步的遗传转化研究将继续以此纯合材料作为试材。利用 RT2PCR方法 , 首次从甜瓜果实中克
隆了 SPS基因的 cDNA片段。测序结果表明克隆的 cDNA片段长 1 408 bp, 推导的氨基酸序列长 469
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　1期 于喜艳等 : 甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因 cDNA片段的克隆及表达分析 　
个氨基酸 , 该基因在 GenBank中登录号为 DQ355797。
经 DNAman分析 , 甜瓜果实 S PS基因 cDNA序列与其它植物 S PS基因的 cDNA序列同源性很高 ,
与番茄的 SPS基因的同源性高达 99% , 与马铃薯、烟草的 S PS基因的同源性分别为 96%和 92% , 与
甘薯、猕猴桃和甜菜的同源性均在 70%以上。
212　甜瓜果实 SPS基因氨基酸序列分析与系统树分析
由甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因的 cDNA序列片段推导的氨基酸序列与其它植物的 S PS基因的氨
基酸序列进行同源性比较 , 结果如图 1。
甜瓜 S PS基因的氨基酸序列与番茄同源性最高 , 达到 98190% , 其次与马铃薯的同源性为
96116% , 与猕猴桃、甘薯和甜菜的同源性分别为 80117%、78168%和 68179%。甜瓜与番茄的
S PS基因的氨基酸同源性最高 , 是由于甜瓜果实和番茄果实蔗糖代谢有着相似的机理 , 而蔗糖磷
酸合成酶是蔗糖代谢相关酶之一。
从图 1也可以看出 , 这几种植物的 S PS基因的氨基酸同源性都很高 , 可能是由于这几种植物
的产品器官形成过程中都有蔗糖积累模式 , 而 SPS在蔗糖积累型库组织中又具有相同作用的结果
(Huber & Huber, 1996)。
图 1　不同植物 SPS氨基酸序列同源性比较
Ⅰ: 甜瓜 (DQ355797) ; Ⅱ: 番茄 (AY726439) ; Ⅲ: 马铃薯 (X73477) ; Ⅳ: 猕猴桃 (AF318949) ;
Ⅴ: 甘薯 (AF439861) ; Ⅵ: 甜菜 (X81975)。
F ig11　A lignm en t of pred icted am ino ac id sequences of SPS genes from d ifferen t plan ts
Ⅰ: Cucm is m elo (DQ355797) ; Ⅱ: Lycopersicon esculen tum (AY726439) ; Ⅲ: Solanum tuberosum (X73477) ;
Ⅳ: Actin id ia chinensis (AF318949) ; Ⅴ: Ipom oea batatas (AF439861) ; Ⅵ: B eta vulgaris (X81975) .
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　　应用 DNAman软件将编码的氨基酸序列及从
GenBank中获取的其它植物的 SPS氨基酸序列进
行系统树分析 , 发现甜瓜的 SPS基因与番茄最先
聚类合并 , 在进化上靠得最近 , 接着与马铃薯聚
合 , 与甘薯在进化上亲缘关系最远。
213　SPS基因的表达特性分析
以甜瓜果实的蔗糖磷酸合成酶基因的 cDNA
片段为探针 , 对甜瓜果实发育中 SPS基因的表达
做了进一步研究。
Northern blot结果表明 , 蔗糖磷酸合成酶基因
在甜瓜花后 5、10、15和 20 d的果实中都没有表
达 , 在花后 25 d的果实中开始表达 , 成熟果实中
表达增强 (图 2)。
图 2　甜瓜果实不同发育时期 SPS基因的表达
1: 花后 5 d; 2: 花后 10 d; 3: 花后 15 d;
4: 花后 20 d; 5: 花后 25 d; 6: 成熟果实。
F ig12　Expression of SPS gene in d ifferen t per iod of m elon fru it
1: 5 days after pollination; 2: 10 days after pollination;
3: 15 days after pollination; 4: 20 days after pollination;
5: 25 days after pollination; 6: Mature fruit.
　　本研究结果与 Lester等 (2001) 对甜瓜蔗糖代谢的生理机制中蔗糖磷酸合成酶变化的研究结果相
吻合 , 甜瓜果实发育初期蔗糖含量很低 , 蔗糖磷酸合成酶活性也很低 , 甚至检测不到 ; 随着果实的成
熟蔗糖含量逐渐增加 , 同时蔗糖磷酸合成酶的活性也逐渐提高 , 到成熟阶段达到最高 , 与果实组织蔗
糖积累跃变期一致。可见蔗糖磷酸合成酶对甜瓜的含糖量起着决定性的作用 , 通过调节该基因的表达
有望改善甜瓜的品质。我们下一步的研究是克隆全长基因 , 进行甜瓜的遗传转化 , 以期丰富甜瓜的种
质资源并获得优质的甜瓜品种。
References
Huber S C, Huber J L. 1996. Role and regulation sucrose phosphate synthase in higher p lants. Annu. Rev. PlantMol. Boil. , 47: 431 - 445.
Lester G E, A rias L S, L im M G. 2001. Muskmelon fruit soluble acid invertase and sucrose phosphate synthase activity and polyp rep tide p rofiles
　　during growth and maturation. J. Amer. Soc. Hort. Sci. , 126: 33 - 36.
Mc Collum T G, Hubert D J. 1988. Soluble sugar accummulation and activity of related enzymes during muskmelon fruit development. J. Amer.
Sci. , 113 (3) : 399 - 403.
Natalie L H, Steven C H. 1989. Sucrose Phosphate synthase and acid invertase as determ inants of sucrose concentration in develop ing muskmelon
　　 (Cucum is m elo L. ) fruit. Plant Physiol. , 91: 1527 - 1534.
Sarahe L, James R D. 1987. Sucrose metabolism in netted muskmelon fruit during development. Plant Physiol. , 84: 386 - 389.
Yu Xi2yan, Zhao Shuang2yi, He Q i2wei, Kong Q ing2guo. 2003. Cloning of acid Invertase cDNA fragment from melon fruit. Acta Horticulturae
Sinica, 30 (3) : 346 - 348. ( in Chinese)
于喜艳 , 赵双宜 , 何启伟 , 孔庆国. 2003. 甜瓜果实酸性转化酶基因 cDNA片段的克隆. 园艺学报 , 30 (3) : 346 - 348.
ZhangM ing2fang, J iang You2tiao, Yu Kang. 1998. Studies on changes between sugar and related enzymes activities during melon fruit development
of different varieties. Acta Zhejiang Agriculture Sinica, 10 (6) : 310 - 312. ( in Chinese)
　　张明方 , 蒋有条 , 余　抗. 1998. 甜瓜不同变种果实发育过程中的糖分转化与酶活性变化. 浙江农业学报 , 10 (6) : 310 - 312.
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