全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2001 , 28 (3) : 251～254
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2000 - 10 - 16 ; 修回日期 : 2001 - 02 - 21
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (39870541)
魔芋 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶大亚基 cDNA
片段的克隆
张兴国1 　杨正安1 　杜小兵2 　李正国2 　刘佩瑛1
(1 西南农业大学园艺系 , 重庆 400716 ;　2 西南农业大学食品科学学院 , 重庆 400716)
摘 　要 : 利用 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶的保守序列设计引物 , 采用 RT2PCR 方法 , 从白魔
芋球茎组织的总 RNA 中扩增出目标 cDNA 片段 , 并克隆到 pUC18 载体中。序列分析后确认该
片段属于一新的 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因。
关键词 : 魔芋 ; RT2PCR ; ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因
中图分类号 : S 632. 3 ; Q 785 　文献标识码 : A 　文章编号 : 05132353X (2001) 0320251204
淀粉约占魔芋球茎干样质量的 15 %～20 % , 是魔芋精粉加工去除的主要杂质〔1〕。常
规育种手段很难培育出低淀粉含量的品种。Murata〔2〕研究发现魔芋球茎中淀粉合成是以
ADP - 葡萄糖作为葡萄糖供体。而 ADP - 葡萄糖由 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶 (AGP) 催化
合成。该酶是淀粉生物合成的关键酶〔3〕。目前已在水稻、小麦和大麦等 20 余种植物中克
隆出该酶的大亚基和小亚基基因。Leidreiter 等〔4〕曾将光合细胞特异启动子控制的 ADP - 葡
萄糖焦磷酸化酶小亚基的反义基因导入马铃薯 , 发现转基因植株叶片中的淀粉合成被显著
抑制。作者从魔芋球茎组织中克隆了 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶大亚基的 cDNA 片段 , 以期
为今后利用其反义基因抑制魔芋淀粉合成 , 从分子水平进行魔芋品质改良奠定基础。
1 　材料与方法
以白魔芋 ( Amorphophallus albus Liu et Chen) 组培苗的幼嫩球茎为材料 , 按 Boehringer
Mannheim公司 RNA 提取试剂 (TripureTM Isolation Reagent) 说明书所示方法 (略作改进) 提
取总 RNA。参照水稻〔5〕、小麦〔6〕和大麦〔7〕等作物的 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶基因的保守
序列 , 设计 5’端引物为 5’2CGCGAGCTCGGTACTGCAGATGCTGT23’(引物 A) 和 3’端引物为
5’2CGGTCTAGAGTACCAATGTCTTCCCAGT23’(引物 B) , 并委托上海植物生理研究所贝克曼
实验室合成。按 Boehringer Mannheim 公司的 RT2PCR 方法 , 将引物 B 和引物 C ( 5’2
TCTAGAT1723’) 分别与逆转录酶 M2MuLV 或 AMV 组合后进行单链 cDNA 合成。再利用引物
A 和引物 B 及高保真的 Taq plus I DNA 聚合酶对该 cDNA 产物进行 PCR 扩增。PCR 反应条
件为 94 ℃变性 4 min , 随后 94 ℃1 min , 55 ℃1 min , 72 ℃1. 5 min , 35 个循环 , 最后 72 ℃
再延伸 10 min。
电泳后低熔点琼脂糖回收和酚 - 氯仿纯化的 RT2PCR 产物 , 经 Xba I 和 Sac I 酶切纯化
后与经同样处理的 pUC18 载体连接。采用热激法转化大肠杆菌 XL12Blue 感受态细胞〔8〕。
酶切和 PCR 检测为阳性的克隆 , 委托北京赛百盛公司和大连宝生物工程有限公司测定
DNA 序列 (序列分析仪为ABI PRIM Model 377) 。采用Blast 2. 0 程序在 GenBank 中搜寻同源
序列 , 确定所分离的基因片段是否属于 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶基因家族。利用 DNAStar、
GenDoc 和 Clustal W 等程序对序列进行同源性和相互关系分析。
2 　结果与分析
2. 1 　魔芋 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶基因
的 RT2PCR扩增
利用设计的引物 A 和引物 B , 从 4 种
3’引物与逆转录酶组合分别合成的 cDNA
中 , 均扩增出 1 条约 510bp 条带 , 片段大
小与预期的一致 (图 1) 。泳道 1 的 RT2PCR
产物回收后用于克隆。
2. 2 　RT2PCR产物的克隆
回收的 RT2PCR 产物经酶切和纯化后
插入 pUC18 载体 , 转化大肠杆菌 , 通过蓝
白筛选得到 7 个白斑菌落。随机挑取 2 个
克隆提取质粒 , PCR 检测结果均为阳性
(图 2 , A ) , Xba I/ SacI 双 酶 切 后 均 有
510 bp 大小的条带 (图 2 , B) 。这表明 RT2
PCR 产物已克隆到载体上。
图 1 　魔芋 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶基因
RT2PCR扩增产物
1. 引物 B 和 M2MuLV ; 2. 引物 C和 M2MuLV ;
3. 100 bp DNA 梯度分子量参照 ; 4. 引物 B 和 AMV ;
5. 引物 C和 AMV ; 6. 无 RNA 模板对照 ; 1、2、4
和 5 的 cDNA 合成在引物和逆转录酶上不同。
Fig. 1 　RT2PCR products of ADP2glucose
pyrophosphorylase gene in Amorphophallus albus
1. Primer B and M2MuLV ; 2. Primer C and M2MuLV ;
3. 100 bp DNA ladder plus marker ; 4. Primer B and AMV ;
5. Primer C and AMV ; 6. Control without RNA template.
The primer and reverse transcriptase used in cDNA
synthesis were different among lane 1 , 2 , 4 and 5.
图 2 　重组子的 PCR和酶切鉴定
1. 白魔芋球茎总 RNA 的 RT2PCR 产物对照 ; 2. 100 bp DNA 梯度分子量参照 ; A23. 1 # 重组质粒的 PCR 产物 ;
A24. 2 # 重组质粒的 PCR 产物 ; B23. 1 # 重组质粒 DNA ; B24. 1 # 重组质粒 XbaI/ SacI 酶切产物 ; B25. 2 # 重组
质粒 DNA ; B26. 2 # 重组质粒 XbaI/ SacI 酶切产物 ; B27. pUC18 DNA ; B28. pUC18 XbaI/ Sac 双酶切产物。
Fig. 2 　Screening of positive construct via PCR and enzyme digestion
1. Control , the RT2PCR product from total RNA of A . albus ; 2. 100 bp DNA ladder plus ; A23. PCR product from
construct 1 # ; A24. PCR product from construct 2 # ; B23. DNA of construct 1 # ; B24. XbaI/ SacI digest
products of construct 1 # ; B25. DNA of construct 2 # ; B26. XbaI/ SacI digest products of construct 2 # ;
B27. pUC18 DNA ; B28. XbaI/ SacI digest products of pUC18.
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2. 3 　魔芋 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶 cDNA片段的序列分析
2. 3. 1 　序列测定 　对 1 # 和 2 # 重组子进行测序。结果显示 2 个重组子插入片段的 DNA
序列一致。双向测序结果表明克隆的 cDNA 片段长 501 bp (不包括两端的 SacI 和 Xba I 酶
切位点) 。推导的氨基酸序列长 167 个氨基酸 (图 3) 。
图 3 　魔芋 ADP - 葡萄糖焦磷酸大亚基 cDNA片段序列及其推导的氨基酸序列
上行为 cDNA 序列 ; 下行黑体为推导的氨基酸序列。cDNA 序列在 GenBank 中的登记号为 AF316326
Fig. 3 　Sequences of cDNA fragment and its deduced amino acid of ADP2glucose pyrophosphorylase large subunit in konjak
The above line showed cDNA sequence , under which the bold letters were the sequence of deduced amino acid.
The cDNA sequence accession number in GenBank is AF316326
2. 3. 2 　同源性分析 　与 GenBank 中的同源
序列比较 , 本研究中所分离的 cDNA 片段
的氨基酸序列与其它物种 ADP - 葡萄糖焦
磷酸化酶大亚基的氨基酸序列同源性多介
于 60 %～76 % , 而与小亚基氨基酸序列同
源性在 58 %以下。其中同西瓜的 ADP - 葡
萄糖焦磷酸化酶大亚基同源性最高 , 达
76 %。据此认为 , 该 cDNA 片段属于 ADP
- 葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因家族 , 而
且属于一个新的基因。命名为 Aa2AGP2L1。
2. 3. 3 　魔芋与其它物种 ADP - 葡萄糖焦
磷酸化酶大亚基的相互关系 　图 4 关系结
构图显示 , 魔芋 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶
大亚基 cDNA 片段所推导的氨基酸序列与
西瓜、甜瓜和番茄等的较为接近 , 与同是
单子叶植物的水稻和小麦等的关系较远。
3 　讨论
图 4 　魔芋 AGP2L1 与其它物种 AGP大亚基
的相互关系
括号内为 GenBank 中的序列登记号
Fig. 4 　Relationship of ADP2glucose pyrophosphorylase
large subunits among konjak and other species
The GenBank accession number of responsive
gene was in the parentheses
　　魔芋 RNA 提取较为困难。一是由于多酚类物质含量高 , 分离获得的 RNA 产率低 , 以
叶片为材料时很难成功。二是由于含有大量的醇不溶性葡甘露聚糖 , 直接按 Boehringer
3523 期 　　　　　　张兴国等 : 魔芋 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶大亚基 cDNA 片段的克隆 　　　　　　
Mannheim 公司的说明书提取的 RNA 中含有大量的胶状粘稠物质 , 给 RT2PCR 扩增带来不
便。本试验对此进行了改进 , 即在沉淀 RNA 时 , 先用 30 %的低浓度乙醇沉淀和去除葡甘
露聚糖 , 然后补加乙醇含量至要求的浓度 (60 %) 。这样回收的 RNA 质量明显提高。
本研究的 PCR 引物是参考 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶 (AGP) 的两个保守区域 GTA2
DAVR 和 YWEDIGT设计的。引物合成时该基因克隆尚少。目前基因库中登记的序列已多
达 150 余个 , 而且在这两个区域均表现出高度保守性。从魔芋材料中扩增出 ADP - 葡萄糖
焦磷酸化酶大亚基基因的同源序列 , 说明本研究设计的两个 PCR 引物具有代表性。
魔芋属于单子叶植物 , 亲疏关系分析却表明 , 它的 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶大亚基片
段的序列与西瓜、甜瓜和番茄等双子叶物种的更为接近 , 但这只是在氨基酸序列可比区域
内的情况。确定魔芋 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶大亚基的亲疏地位 , 尚有待该基因的完整分
离。此外 , 魔芋 ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶大亚基片段与其它物种的同源性较低 , 亦反映了
ADP - 葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因不太保守的特性〔9〕。
参考文献 :
1 　刘佩瑛 , 张盛林 , 张兴国. 中国魔芋科学技术的研究和应用. 西南农业大学学报 , 1995 , 11 (增刊) : 1～13
2 　Murata T. Composition of soluble nucleotides in growing corms of A . konjac C. Koch. Agri . Biol . Chem. , 1975 , 39 (7) :
1401～1406
3 　Okita T W , Nakata P A , Anderson J M. The subunit structure of potato tuber ADP2glucose pyrophosphorylase. Plant Physiol . ,
1990 , 93 : 785～790
4 　Leidreiter K, Heineke D , Heldt H W , et al . Leaf2specific antisense inhibition of starch biosynthesis in transgenic potato plants
leads to an increase in photoassimilate export from source leaves during the light period. Plant Cell Physiol . , 1995 , 36 (4) : 615
～624
5 　Anderson J M , Hnilo J , Larson R , et al . The encoded primary sequence of a rice seed ADP2glucose pyrophosphorylase subunit and
its homology to the bacterial enzyme. J . Biol . Chem. , 1989 , 264 : 12238～12242
6 　Olive M R , Ellis R J , Schuch W W. Isolation and nucleotide sequences of cDNA clones encoding ADP2glucose pyrophosphorylase
polypeptides from wheat leaf and endosperm. Plant Mol . Biol . , 1989 , 12 : 525～538
7 　Villand P , Aolen R , Olsen O A , et al . PCR amplification and sequences of cDNA clones for the small and large subunits of ADP2
glucose pyrophosphorylase from barly tissues. Plant Mol . Biol . , 1992 , 19 (3) : 381～389
8 　Sambrook J , Fritsch E F , Maniatis T. Molecular cloning : A laboratory manual . NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press ,
1989. 251～272
9 　Smith2White B J , Preiss J . Comparision of protein of ADP2glucose pyrophosphorylase from diverse sources. Plant Mol . Biol . ,
1992 , 34 (5) : 449～464
Isolation of a cDNA Fragment Homologous to the Large Subunit Gene
of ADP2Glucose Pyrophosphorylase from Amorphophallus
Zhang Xingguo1 , Yang Zheng’an1 , Du Xiaobing2 , Li Zhengguo2 , and Liu Peiying1
(1 Department of Horticulture , Southwest Agricultural University , Chongqing 400716 ;　2 College of Food Sciences ,
Southwest Agricultural University , Chongqing 400716)
Abstract : PCR primers were designed based on the consensus domain of ADP2glucose pyrophos2
phorylase. A cDNA fragment was amplified from the total RNA isolated from the yang corm of Amor2
phophallus albus via RT2PCT and cloned into plasmid pUC18. The determined sequence showed this
cDNA fragment was homologous to the large subunit gene of ADP2glucose pyrophosphorylase.
Key words : Amorphophallus ; RT2PCR ; ADP2glucose pyrophosphorylase large subunit gene
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