全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2003 , 30 (5) : 589～591
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2002 - 09 - 09 ; 修回日期 : 2003 - 01 - 06
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30070492)
番茄 myb 基因片段的克隆及在过敏性反应时的表达
蔡新忠1 　徐幼平2 　楼　健2
(1 浙江大学植物保护系 , 杭州 310029 ; 2 浙江大学分析测试中心 , 杭州 310029)
摘 　要 : 以烟草 myb1 中 MYB 保守区域编码序列的两个相对特异性序列为引物 , 以表现过敏性反应
(hypersensitive response , HR) 的番茄苗中提取的 RNA 为模板 , 通过 RT - PCR 获取长度为 215 bp 的 myb 基因
片段LeMYB1 和 LeMYB2 ( GenBank 核酸序列数据库登录号 : AY131230 和 AY131231) 。两者只有第 63 位碱基不
同 , 前者序列为 A , 而后者为 G。Northern 杂交分析表明 , LeMYB 相关基因表达时序与番茄苗 HR 的产生和
发展呈密切正相关 , 因而可能在 Cf29 决定的 HR 和抗病性产生中起调节作用。
关键词 : 番茄 ; LeMYB ; 转录因子 ; 基因表达 ; Cf29 ; 过敏性反应
中图分类号 : S 64112 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2003) 0520589203
1 　目的、材料与方法
植物 MYB 转录因子是动物 c2MYB 原癌基因产物的类似物 , 在植物过敏性反应 (hypersensitive re2
sponse , HR) 和植物抗病性产生中起重要调节作用〔1 ,2〕。为研究转录因子在植物抗病基因 ( resistance
gene , R) 决定的抗病性中的作用 , 通过 RT - PCR 方法克隆了两个番茄 myb 片段 , 并分析了相关基因
在番茄苗中 HR 产生和扩展时的动态表达。
分别以 MM2Cf9 植株和转番茄叶霉菌 ( Cladosporium f ulvum) Avr9 基因的 MM2Cf0 植株为父本和母
本进行杂交 , 获取含 Avr9/ Cf29 基因对的番茄种子〔3〕。种子催芽后播于育苗盘 , 置于 25 ℃, 光 16 h/
暗 8 h 周期的温室中培养。番茄苗分别于露土 1～6 d 逐天取样 , 按 Cai 等的方法进行总 RNA 的分离 ,
凝胶电泳 , 杂交膜的印迹 , 探针的制备〔4〕。用于杂交分析的探针包括本研究中克隆的 LeMYB1 cDNA
以及萝卜 18S rDNA 117 kb EcoRI片段。探针与印迹膜于 65 ℃杂交 15 h , 再于 65 ℃, 含 011 % SDS 的 3
×SSC , 1 ×SSC和 015 ×SSC依次洗涤 15 min。然后 - 80 ℃放射自显影于 Kodak XAR5 胶片。
选择烟草 myb1 中 MYB 保守区域的相对特异性序列作为引物。一对为 myb 保守的 DNA 结合域序
列。上游引物 mybE 序列为 : 5pi2GGCTGGACTATTGAGATGCGG23pi。下游引物 mybG 序列为 : 5pi2
TCTTCTTCAAGTGGGTGTGCC23pi。另一对引物为 DNA 结合域外侧非保守域序列。上游引物 mybC 序列
为 : 5pi2TCCTTGTTGTGAGAAAATGG23pi。下游引物 mybD 序列为 : AGGAGCTAGCACTGGGCTATC23pi。RT2
PCR采用 SUPERSCRIPTTM ONE2STEPTM RT - PCR 试剂盒 (Life Technologies , Inc. ) , 先于 50 ℃反应 30
min , cDNA 合成后于 94 ℃预变性 2 min , 再按 94 ℃变性 15 s , 60 ℃退火 30 s , 72 ℃延伸 1 min , 反应 30
个循环。PCR 产物通过琼脂糖凝胶分离 , 回收后与 p GEM2T 载体 ( Promega , USA) 连接 , 通过 Gene
Pulser Ⅱ (Bio2Rad , USA) 电转化感受态大肠杆菌细胞。经氨苄青霉素和蓝白菌落筛选、菌落 PCR 验
证等步骤后 , 提纯质粒 , 通过自动测序系统 (model 373A ; Applied Biosystems) 获取序列。通过 BLAST
软件 (NCBI , USA) 进行同源序列的搜索。
2 　结果与分析
211 　番茄 myb 基因片段的克隆和序列分析
从露土 4 d 的 Avr9/ Cf29 番茄苗中分离总 RNA , 作为 RT - PCR 模板。结果发现 , 以 myb 保守序列
作为引物设计位点的 mybE/ mybG引物对 RT - PCR 反应形成长约 220 bp 的特异性产物 , 而以单引物 ,
无反转录酶和无 RNA 模板对照的非保守序列作为引物设计位点的 mybC/ mybD 引物 , 对 RT - PCR 反
应不形成任何产物。
PCR 产物经过多次序列测定 , 发现其包含长度均为 215 bp 的两种序列 , 称为 LeMYB1 和LeMYB2。
两者只有第 63 位碱基不同。前者序列为 A , 后者为 G。此为单核苷酸突变导致。前者序列为天冬氨
酸 ( GAT) , 后者则为甘氨酸 ( GGT) 。LeMYB1 和 LeMYB2 在 GenBank 核酸序列数据库〔5〕的登录号分别
为 AY131230 和 AY131231。LeMYB1 序列见图 1 , 包含 myb 保守重复序列 R2 的最后部分及重复序列 R3。
图 1 　LeMYB1 的 cDNA和氨基酸序列
LeMYB1 和 LeMYB2 的差异序列以加框表示。
Fig. 1 　cDNA and predicted amino acid sequence of LeMYB1
Framed are the sequence of LeMYB1 distinct from that of LeMYB2.
通过 BLAST搜索发现 , LeMYB1 与已报道植物 myb 的相应片段有很高的序列一致性。尽管 RT -
PCR 引物完全按烟草 myb1 序列设计 , 但 LeMYB1 与一致性最高的不是烟草 myb1 , 而是番茄 THM18
基因 , 两者在 DNA 序列上仅于上游引物序列第一个核苷酸及下游引物中 2 个核苷酸不同 , 其余 212
个核苷酸完全一致。上游引物核苷酸因不在已知编码框内 , 故不知是否导致氨基酸变化。下游引物中
一个核苷酸导致相应氨基酸的变化 , 另一个则没有。THM (tomato hypocotyl Myb) 是 Lin 等〔6〕获得的
myb 相关基因 (片段) 克隆 , 其功能尚不清楚。报道的 THM 克隆有 14 个。LeMYB1 与 THM 序列
( THM18 除外) 一致性明显低 , 而与烟草 myb1 序列在 DNA 或氨基酸水平均有明显区别。
212 　LeMYB1 相关基因在 Avr9/ Cf29 番茄苗中的表达
为了观察 LeMYB1 相关基因在 Cf29 决定的 HR 和抗病性中的作用 , 以克隆的 LeMYB1 cDNA 为探针
图 2 　LeMYB1 相关基因在番茄苗中的表达
总 RNA 分别分离自露土 1～6 d 只含 Avr9 (A) 或 Cf29 (C) 以及同含 Avr9/ Cf29 (H) 的番茄苗。
Fig. 2 　Expression of LeMYB12related genes in tomato seedlings
Total RNA was isolated from tomato seedlings containing Avr9 (A) , Cf29 (C) and both Avr9 and Cf29 (H) at
1 to 6 days after emergence of hypocotyls above soil .
进行了 Northern 杂交分析。总 RNA 分离自两类番茄苗。一类只含 Avr9 或 Cf29 基因 , 它们不会产生
HR。另一类同含 Avr9 和 Cf29 基因 , 该苗随互补基因对 Avr9/ Cf29 的表达 , 激活抗病反应和 HR〔3〕。如
图 2 所示 , LeMYB1 相关基因在只含 Avr9 或 Cf29 基因的番茄苗中有较低水平的组成性表达。但在
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Avr9/ Cf29 苗中的表达与其 HR 坏死斑产生扩展时序呈密切正相关。Avr9/ Cf29 苗在露土 4 d 时 , 极少
数坏死斑点出现于子叶背面 , 此时 LeMYB1 相关基因的表达明显受到诱导。此后子叶坏死小斑增大 ,
数目增多 , LeMYB1 相关基因的表达水平也随着增高 (图 2) 。说明 LeMYB1 相关基因可能在 Cf29 决定
的 HR 和抗病性产生中起调节作用。LeMYB1 相关基因的克隆将为该基因的功能研究奠定必要基础。
图 2 显示杂交信号包括两条带 , 说明 LeMYB1 相关基因不止一个 , 可能为基因家族中的一员。这与该
片段编码 myb 保守序列 , 而且本研究克隆到 LeMYB2 的事实相符。也与以烟草 myb1 为探针的 Northern
分析中发现有两条杂交带的报道相似〔2〕。
参考文献 :
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tomato , but similar patterns of defence2related gene expression. Molecular Plant Pathology , 2001 , 2 (2) : 77～86
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Ailsa Craig) . Plant Mol . Biol . , 1996 , 30 : 1009～1020
Cloning of Tomato myb Gene Fragments and Expression upon Development of
Hypersensitive Response
Cai Xinzhong1 , Xu Youping2 , and Lou Jian2
(1 Department of Plant Protection , Zhejiang University , Hangzhou 310029 , China ; 2 Center of Analysis and Measurement , Zhejiang
University , Hangzhou 310029 , China)
Abstract : Two 215 bp myb gene fragments , LeMYB1 and LeMYB2 with GenBank accession No. AY131230
and AY131231 respectively , were cloned through RT - PCR. The primers were designed in accordance with tobac2
co myb1 at the DNA2binding domain conserved in MYB , and the template was the RNA isolated from tomato
seedlings showing hypersensitive responses (HR) . Only nucleotide 63 was different between the two fragments , of
which LeMYB1 was A and LeMYB2 was G. Three nucleotides within the primers for cloning of LeMYB1 were dif2
ferent between LeMYB1 and counterpart of THM18 , whereas 9017 % nucleotide sequence of LeMYB1 was identical to
corresponding parts of tobacco myb1. Northern assay revealed that expression of LeMYB12related genes were
induced upon occurrence of hypersensitive necrosis in tomato seedlings and enhanced henceforth. Their coincident
expression with HR development in tomato indicated that LeMYB12related genes might be involved in regulation of
HR and disease resistance conferred by tomato fungal resistance gene Cf29.
Key words : Tomato ; LeMYB ; Transcription factor ; Gene expression ; Cf29 ; Hypersensitive response
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