全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (5) : 875～877
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 02 - 25; 修回日期 : 2005 - 05 - 23
基金项目 : 教育部 ‘青年教师奖励基金’资助项目 ; 国家转基因植物专项资助项目 (JY04 - B - 02)3 通讯作者 Author for correspondence
苹果品种的 SSR分析
王爱德　李天忠　许雪峰　韩振海 3
(中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100094)
摘 　要 : 利用 SSR方法对苹果 25个品种进行了基因组多态性分析 , 从 20对引物中筛选出 10对多态性
引物用于正式扩增 , 一共扩增出 97个位点 , 平均每对引物扩增出 917个位点 , 扩增条带的多态性百分率在
5614% ～100%之间。用两对引物 ( GD142和 02b1) 即可区分全部供试品种。根据 SSR分析结果 , 应用
NTSYS软件进行相似性系数计算 , 利用 UPGMA法构建聚类树状图。其结果表明 , 供试苹果品种分为 4个
类群 , 与传统系谱基本一致。
关键词 : 苹果 ; SSR; 品种鉴定 ; 指纹图谱
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0520875203
SSR Ana lysis for Apple Cultivars
W ang A ide, L i Tianzhong, Xu Xuefeng, and Han Zhenhai3
( Institu te for Horticu ltura l P lan ts, Ch ina A gricu ltura l U niversity, B eijing 100094, Ch ina)
Abstract: By using simp le sequence repeat ( SSR) , 25 app le cultivars were used for genom ic polymor2
phic analysis. 97 alleles were amp lified by using 10 pairs of p rimers selected from 20 pairs, of which average
917 alleles per pair of p rimer were amp lified and polymorphic percentage of amp lified band was 5614% -
100%. Two pairs of p rimer ( GD142 and 02b1) could distinguish all cultivars used in the study. Based on the
SSR results, calculation of the sim ilarity coefficient and also UPGMA cluster analysis showed that the app le
cultivars could be classified into the four group s of being sim ilar to the traditional classification.
Key words: App le; SSR; Cultivar identification; Fingerp rinting
1　目的、材料与方法
苹果品种鉴定是苹果种质资源研究的基础。本研究应用 SSR分子标记技术鉴定 25个苹果品种并
绘制指纹图谱 , 以期为苹果种质资源鉴定和品种亲缘关系分析在分子水平上提供依据。
试材 (表 1) 取自中国农业科学院果树研究所 (兴城 ) 苹果种质资源圃。取 1年生枝条上的健康
嫩叶备用。基因组 DNA提取与纯化按照邹喻苹等〔1〕的方法 , 提取的 DNA质量和浓度经琼脂糖凝胶电
泳和紫外分光光度计检测合格后 , 将样品稀释到 50 ng·μL - 1保存备用。 SSR引物按 Guilford等〔2〕、
Hokanson等〔3〕、Gianfranceschi等〔4〕报道的序列由上海 Sangon公司合成 , 由 20对引物筛选出稳定性
强、多态性好的 10对引物进行正式试验 , 引物的退火温度经筛选试验获得。PCR扩增仪为美国 MJ
公司生产的 PTC - 200。SSR反应条件经过优化确定为 : 15μL体系含 50 ng基因组 DNA, Tris - HCl
10 mmol·L - 1 (pH 91 0) , KCl 50 mmol·L - 1 , MgCl2 1167 mmol·L - 1 , dNTP 0125 mmol·L - 1 , 引物
0133μmol·L - 1 , Taq聚合酶 1 U。PCR程序是 : 94℃预变性 5 m in, 然后 94℃变性 30 s, 60℃退火 1
m in, 72℃延伸 1 m in, 35个循环 , 最后 72℃延伸 5 m in。扩增产物用 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,
银染检测〔5〕。电泳图谱的每条带均为一个分子标记 , 代表一个引物的结合位点。根据条带的有无统
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
计所有的二元数据 ; 有带记作 1, 无带记为 0, 根据二元数据计算多态性位点百分数 , 采用 NTSYS统
计分析软件〔7〕对数据进行分析 , 品种间的相似系数按 Jaccard公式计算 , 以非加权类平均法 (UPG2
MA ) 进行聚类分析 , 并建立树状图。
表 1　供试苹果品种
Table 1　Apple cultivars used in th is study
编号
No.
品种
Varieties
亲本或起源
Parents or O rigin
编号
No.
品种
Varieties
亲本或起源
Parents or O rigin
1 金冠 Golden Deli. 不详 Unknown 14 新乔纳金 New Jonagold乔纳金芽变 Spot of Jonagold
2 国光 Ralls 不详 Unknown 15 印度 Indo 不详 Unknown
3 金星 Kinsei 金冠 ×国光 Golden Deli. ×Ralls 16 王林 O rin 金冠实生 Seeding of Golden Deli.
4 富士 Fuji 国光 ×元帅 Ralls ×Delicious 17 陆奥 Mutsu 金冠 ×印度 Gold Deli. ×Indo
5 华冠 Huaguan 金冠 ×富士 Golden Deli. ×Fuji 18 东光 Toko 金冠 ×印度 Gold Deli. ×Indo
6 清明 Q ingm ing 金冠 ×富士 Golden Deli. ×Fuji 19 黄魁 Yellow Transparent. 不详 Unknown
7 元帅 Delicious 不详 Unknown 20 甜丰 Tianfeng 黄魁 ×金冠 Yellow Transparent. ×Gold Deli.
8 世界一 Sekaiichi 元帅 ×金冠 Delicious ×Golden Deli. 21 翠秋 Cuiqiu 金冠 ×黄魁 Golden Deli. ×Yellow Transparent.
9 红玉 Jonathan 可口香实生 Seeding of Esopus Spitzenburg 22 嘎拉 Gala 红基橙 ×金冠 Kiddpis Orange Red ×Gold Deli.
10 初秋 Hatsuaki 金冠 ×红玉 Golden Deli. ×Jonathan 23 粉红女士 Pink Lady 金冠 ×威廉女士 Gold Deli. ×Lady W illiam s
11 津轻 Tsgaru 金冠 ×红玉 Golden Deli. ×Jonathan 24 秦冠 Q inguan 金冠 ×鸡冠 Gold Deli. ×J iguan
12 红月 Kogetsu 金冠 ×红玉 Golden Deli. ×Jonathan 25 鸡冠 J iguan 不详 Unknown
13 乔纳金 Jonagold 金冠 ×红玉 Golden Deli. ×Jonathan
2　结果分析与讨论
211　引物筛选与 SSR多态性
从 20对 SSR引物中筛选出 10对多态性较高、
稳定性较好、分辨率较高的引物。10对引物在 25
个苹果品种中共在 97个位点上扩增出条带 , 平均
每对引物有 917个扩增位点 , 每对引物可以检测
到等位位点的个数从 6～17个不等 ; 每对引物的
多态性百分率在 5614% ～100%之间 , 10对引物
对 25个苹果品种的分辨率均在 55%以上 (表 2)。
引物 GD142和 02b1即可将所有的品种区分开 ,
分辨率分别为 78%和 88%。
分析引物 02b1构建的指纹图谱 (图 1) 可以
看出 : 一些品种的亲缘关系较近带型相似 , 例如
表 2　10对 SSR引物对 25个供试苹果品种的扩增结果
Table 2　Amplif ied results of 25 apple cultivars with 10 SSR primers
引物
Primer
退火温度
Annealing
temperature (℃)
等位位点
No. of alleles
detected
多态性带比例
Ratio of polymor2
phic bands( % )
CH02F06 60 7 8114
CH01F09 60 9 7315
04h11 53 6 7818
CH01H10 62 7 8210
CH02D12 66 9 6519
CH02D11 64 7 6613
CH01G12 56 8 5614
GD142 56 15 10010
GD147 58 17 8616
02b1 65 12 10010
‘初秋 ’ (10) 和 ‘乔纳金 ’ (13) , ‘鸡冠 ’ (25) 和 ‘秦冠 ’ (24) ; 而有些品种亲缘关系虽近 , 但
带型差异却较大 , 例如 ‘津轻 ’ (11) , ‘红月 ’ (12) 和 ‘初秋 ’ (10) , ‘陆奥 ’ (17) 和 ‘东光 ’
(18) ; 有些品种亲缘关系较远却有极相似的带型 , 例如 ‘元帅 ’ (7) 和 ‘初秋 ’ (10) , ‘红玉 ’
(9) 和 ‘黄魁 ’ (19)。说明在基因型高度杂合的苹果品种群体内存在极为复杂的谱带关系。这与夏
阳〔6〕对 31个苹果品种进行同工酶分析得出的结论相似。
212　苹果品种的聚类分析
根据 10对引物的扩增数据计算品种间的相似系数并进行聚类 (图 2)。25个苹果品种的相似系
数在 01601～01953之间 , 平均为 01793。25个苹果品种均能分开 , 在相似系数为 0168处可以分为 4
个类群 , 类群 Ⅰ包括一个品种 , 即 ‘红玉 ’ (9) ; 类群 Ⅱ由两个品种组成即 ‘秦冠 ’ (24) 和 ‘鸡
冠 ’ (25) , ‘鸡冠 ’是 ‘秦冠 ’的父本 , 这两个品种聚为一类说明 ‘秦冠 ’在遗传上更多地继承了
‘鸡冠 ’的遗传物质 ; 类群 Ⅲ由 3个品种组成 , 分别为 ‘金星 ’ (3)、‘嘎拉 ’ (22) 和 ‘粉红女士 ’
(23) , 这 3个品种都含有金冠的血缘 ; 类群 Ⅳ由另外 19个品种组成 , 聚类结果与传统系谱基本一致。
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　5期 王爱德等 : 苹果品种的 SSR分析 　
图 1　引物 02b1对 25个苹果品种的 SSR扩增情况
编号见表 1, 下同。M: Gene RulerTM 50 bp DNA ladder p lus.
F ig. 1　Am plif ica tion of pr im er 02b1 in 25 cultivars of apple
The same series No. as in Table 1. The same below. M: Gene RulerTM 50 bp DNA ladder p lus.
　　在 02b1这个位点上 , 有些品种虽然具有相同
的带型 (图 1) , 但是在另外 9个位点上差异较
大 , 所以它们之间的相似系数较小 , 例如 ‘秦
冠 ’ (24) 和 ‘鸡冠 ’ (25) , ‘国光 ’ ( 2) 和
‘粉红女士’ (23)。
聚类结果与传统系谱也存在差别 , 例如 ‘国
光 ’ (2) 没有和 ‘金星 ’ (3) 聚到一起 , ‘初
秋 ’ (10)、‘津轻 ’ ( 11)、‘红月 ’ ( 12) 和
‘乔纳金 ’ (13) 也没有紧密地聚到一起。原因一
是生产上常用苹果品种是依据其商业性状进行人
工选择 , 所检测的位点可能与其重要的商业性状
图 2　供试品种相似性树状图
F ig. 2　D endrogram of sim ilar ity am ong cultivars in th is study
不是连锁的 ; 二是不同的选择标准导致了复杂的遗传多样性 ; 三是所检测的位点较少 , 不能完全反映
出整个苹果基因组的复杂情况 , 导致系谱偏离。
SSR分析中最重要的环节是引物的筛选 , 只要能开发出合适的引物并对分析体系进行优化就能
挖掘 SSR在种质资源研究中的巨大潜力。本试验通过对 25个苹果品种的 SSR分析 , 可见 DNA多
态性丰富 , 其中某些特征条带可以作为品种转育过程中的血缘控制加以利用。本试验结果将为苹
果杂交育种过程中的血缘控制和亲本选配以及研究物种起源和演化提供技术和理论支持。
参考文献 :
1　邹喻苹 , 葛　颂 , 王晓东. 系统与进化植物学中的分子标记. 北京 : 科学出版社 , 2001. 18～19
Zou Y P, Ge S, W ang X D. Molecular marker in system ic and evolutionary botany. Beijing: Science Press, 2001. 18～19 ( in Chinese)
2　Guilford P, Prakash S, Zhu J M, R ikkerink E, Gardiner S, Bassett H, Forster R. M icrosatellites in M alus ×dom estica ( app le) : abundance,
polymorphism and cultivar identification. Theor. App l. Genet. , 1997, 94: 249～254
3　Hokanson S C, LamboyW F, Szewc2McFadden A K, McFerson J R. M icrosatellite ( SSR) variation in a collection ofM alus ( app le) species
and hybrids. Euphytica, 2001, 118: 281～294
4　Gianfranceschi L , Seglias N, Tarchini R, Kom janc M, Gessler C. Simp le sequence repeats for the genetic analysis of app le. Theor. App l.
Genet. , 1998, 96: 1069～1076
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6　夏　阳. 苹果过氧物同工酶研究. 甘肃农业大学学报 , 1996, 31 (1) : 77～80
Xia Y. Studies on isoperoxidase of app le cultivars. Journal of Gansu Agricultural University, 1996, 31 (1) : 77～80 ( in Chinese)
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