全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 1) : 57~ 58
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2000- 04- 22; 修回日期: 2000- 11- 20
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39670521) ; 山东省 三零 工程资助项目
超强表达豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 ( CpTI)
转化苹果的研究
达克东1 崔德才1 张 松1 金德敏2 王 斌2 束怀瑞1
( 1山东农业大学园艺系 , 泰安 271018; 2 中国科学院遗传研究所, 北京 100101)
摘 要: 通过农杆菌介导法将超强表达载体 PECp 中的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 CpTI转
入了苹果品种 !嘎拉∀ 。GUS检测和 Southern 杂交结果证明 CpTI基因已经整合进苹果基因组。
关键词: 苹果; CpTI; 超强启动子; 基因转化
中图分类号: S 661. 1 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 01005702
1 目的、材料与方法
苹果遗传转化工作有一些报道, 多是以报告基因为目的基因的转化#1, 2∃, 功能基因转
化工作报道较少。启动子是DNA分子上结合 DNA 聚合酶并形成转录起始复合物的区域,
真核基因表达受启动子控制, 花椰菜花叶病毒启动子 ( CaMV35S) 是广泛用于植物遗传转
化的启动子。但在一些植物转化中, 存在表达量不足的问题。由于抗性能力取决于基因表
达积累量, 基因表达量可以通过使用强于 35S的强启动子或超强启动子来提高。本试验使
用的超强启动子来自增加了 ocs上游调控序列的甘露碱合酶启动子, 该启动子启动的 GUS
基因在烟草中的表达强度分别是35S和双 35S启动子的 156倍和 26倍#3∃。豇豆胰蛋白酶抑
制剂基因 CpTI具有广谱抗虫特性, 是目前比较理想的抗虫基因。本文报道豇豆胰蛋白酶
抑制剂基因超强表达载体对苹果的遗传转化。
苹果栽培品种 !嘎拉∀ 脱毒试管苗由本室保存, 培养方法见参考文献 #4∃, 含有超强
启动子和 CpTI基因的双元表达载体质粒 PECp是由作者在中国科学院遗传研究所构建的,
农杆菌 LBA4404为本室保存菌种, 限制性内切酶和琼酯糖购自 Promega公司, 蛋白胨、酵
母提取物购自 Oxoid公司, 32PdATP 购自北京亚辉公司, 细胞分裂素、6- 苄基腺嘌呤
(BA) 为华美公司产品, 其它化学试剂为国产分析纯试剂。引物 1: 5%GATGATGGTGC
TAAAGGTGT3%; 引物 2: 3%CCTACTTCTACTACTCATTC5%是根据报道序列, 由上海生工生物
工程公司合成。
农杆菌介导的苹果遗传转化: 以 30日龄无菌试管苗顶部前 3片展开叶为外植体, 在
MS+ BA 1 mg/ L培养基上预培养 2 d后, 用培养至对数生长期的用等体积MSO悬浮的农杆
菌中浸泡 5~ 10 min, 无菌滤纸吸除叶片上多余菌液, 将叶片接种于共培养培养基MS+ BA
1 mg/ L 上。培养2 d后叶片用无菌水洗 3遍, 再用含 Cef 400 mg/ L的MSO冲洗 2遍, 无菌
滤纸吸除叶片上的多余液体, 将叶片置于选择培养基 MS+ BA 1 mg/ L+ Km 5 mg/ L+ Cef
300 mg/ L 上。培养 10 d后转入去掉Km的分化培养基, 分化出芽后将分化芽转至含Km的
繁殖培养基再选择培养, 获得抗性植株后转入MS+ IBA 0. 2 mg/ L 生根培养基中生根。
GUS染色、DNA 提取、PCR 和 Southern杂交方法按参考文献 #5∃ 进行。探针来自
PBluescriptL3经Hind&/ BamHI双酶切后 Geneclean回收的 326bp的CpTI基因片段。
2 结果与分析
2. 1 卡那霉素对苹果叶片再生的影响 卡那霉素是遗传转化中转化体的选择剂, 随 t
DNA进入转化体的 NPT∋基因具有卡那霉素抗性。在选择培养基上, 转化体表现为绿色,
非转化体表现为白色。试验中以附加卡那霉素 0、1、2、4、8 mg/ L 的分化培养基进行嘎
拉叶片卡那霉素抗性试验, 结果叶片再生率分别为90%、78%、38%、0和 0。可以看出,
嘎拉苹果对卡那霉素非常敏感, 4 mg/ L 浓度足以抑制叶片分化。试验中以 5 mg/L 卡那霉
素进行转化体筛选。
2. 2 农杆菌介导的CpTI基因转化苹果 以嘎拉叶片不定芽再生体系为转化受体系统, 进
行农杆菌介导的 CpTI基因转化试验, 结果如下: 接种叶片 500个, 产生抗性芽叶片 63
个, 产生抗性芽数 85个, 抗性芽产生率为 17%。产生的卡那霉素抗性芽 (插页 1, 图版,
A) , 每 20 d转接 1次, 连续转接 3次后大部分芽生长不正常, 表现为生长势弱, 连续选
择后失去生活力, 逐渐死亡, 白化, 基部愈伤化; 少数生长正常。取生长正常植株器官进
行组织化学和分子检测。
2. 3 转化植株的分子生物学检测 GUS染色鉴定: 转化植株根可以被 GUS染色剂染色而
显蓝色, 未转化植株的根不能被染色 (插页 1, 图版, B)。从 3次转接后生长正常的 16
个单株中得到 4株 GUS阳性株系。Southern杂交检测: 质粒 PECp经 XbaI/ SmaI双酶切后在
326bp处产生目的基因条带, 转基因株系 1号的DNA经 PstI完全酶解, 转膜杂交后有两条
杂交信号带产生 (插页 1, 图版, C) , 说明目的基因存在于苹果基因组上。阴性对照植株
无杂交信号。苹果转化植株的表达研究正在进行中。
参考文献:
1 程家胜, Dandekar A M, Uratsu S L, 等. 苹果转基因技术初报. 园艺学报, 1992, 19: 101~ 104
2 张志宏, 景士西, 王关林, 等. 新乔纳金苹果遗传转化及转基因植株再生. 园艺学报, 1997, ( 4) : 378~ 380
3 Ni M, Cui D, Einstein S, et al. Strength and t issue specificity of chimeric promotors derived from the octopine and mannapine syn
thase genes. The Plant Journal , 1995, 7 ( 4) : 661~ 676
4 达克东, 李雅志, 束怀瑞. 苹果叶片愈伤组织植株再生研究. 核农学报, 1995, 9 (3) : 139~ 143
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Transformation of Apple Using Super Expression Cowpea Trypsin Inhibitor
( CpTI) Gene
Da Kedong1, Cui Decai1, Zhang Song1, Jing Demin2, Wang Bin2, and Shu Huairui1
( 1Department of Horticulture, Shandong Agricultural University , Tai∀ an 271018; 2 Institute of Genetics , Acadmia
Sinica, Beijing 100101)
Abstract: Cowpea trypsin inhibitor ( CpTI) gene in super expression binary vector PECp was transferred to apple
cultivar !Gala∀ using Agrobacterium mediated leaf disc transformation method. GUS staining and southern blot con
firmed that CpTI gene was inserted into apple genome.
Key words: Apple; CpTI gene; Super Promoter; Transformation
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