全 文 ：园 艺 学 报 2O03，30(2)：227～228
Acta Horticulturae Siniea
— — — — — — — — — —
‘翠秀 ’黄瓜子叶原生质体的高效培养及植株再生
郭德章 鄢 铮 赖钟雄2 林庆 良2 王家福2
( 福州市农业科学研究所 ，福州 350019； 福建农林大学亚热带果树研究所，福州 350002)
摘 要：分离纯化的黄瓜子叶原生质体，以5．5×10～5．5×105个／mL的不同密度培养于 mKMSp液体
培养基中，均获得不同程度的细胞分裂。当培养密度超过 1．0×103个／mL时，原生质体可持续分裂至愈伤
组织形成，最高植板率为54％。原生质体来源的愈伤组织经诱导培养产生大量体胚并再生成植株。c_2 浓
度对黄瓜原生质体的稳定和细胞分裂有重要影响。
关键词：黄瓜；子叶；原生质体；植株再生
中图分类号 ：S 642．2 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2o03)02-02274~
1 目的、材料与方法
黄瓜 (Cucum／s sativus L．)器官发生和体细胞胚胎发生途径获得原生质体再生植株，已有较多报
道，但大部分离实用仍有差距。本研究以黄瓜子叶为试材，探讨原生质体分离、培养及植株再生的关
键因子及其低密度培养的可能性，为黄瓜原生质体培养的实用化积累更多技术。黄瓜杂交品种 ‘翠
秀’的Fl代种子无菌播种6 7 d后，取指数生长前期的子叶分离、纯化原生质体【l】。酶液组成为：
2％纤维素酶Onozuka R．10，1％果胶酶 Peetinase(Serva)，MES(吗啡啉乙磺酸)3 mn~l／L，甘露醇 0．5
mol／L，0．5％PVP(聚乙烯吡咯啉酮)及CPW盐类 (ca2 降至1 retool／L)。原生质体培养基mKM8p为
含 Ca2 1 mmol／L，蔗糖 1．0 g／L，萄葡糖 62 L并附加2，4．D 1．0 mg／L，NAA 0．8 mg／L，BA 0．2 mg／L
的改良KM8p培养基。原生质体分别以不同密度浅层培养【2]于 6 cm培养皿中。当再生的愈伤组织直
径达 0．5—1．5 cm时，及时转入改良的 MS(KNO3 1200 mg／L，N~NO3 600 mg／L，维生素 Bl 1．0 mg／L)
附加不同生长激素的培养基上诱导分化及再生。检测再生植株的倍性【3J。
2 结果分析与讨论
2．1 原生质体的分离及培养 ．
试验结果显示，以每 l0 mL酶液中0．16—0．24 g的子叶用量能获得较高原生质体产量和成活率
(图 1)。当植板密度较高 (5．0×105，5．0×104个
／mL)时，原生质体在培养 48 h后开始首次分裂
(插页 2图版，B)，第 8一l0天形成大量肉眼可见
的体细胞克隆 (插页 2图版 ，C)；当植板密度较
低 (5．0×103，5．0×102，5．0×10个／mL))时，
首次分裂推迟至培养后第 72 120 h。在 5种植板
密度处理中，密度较高的 3个处理中能观察到原
生质体多次持续分裂，直至形成小克隆，植板率
分别为 38％、54％和 1．5％。密度较低的两个处
理中原生质体可持续 2 3次分裂，但无法进一步
形成细胞团。我们发现，黄瓜原生质体在KM8p
收稿日期：2O02—05—21；修回日期：21O2—09—23
锝
赡
烛
餐
隧
● ]． ]L
每lOmL酶浪中子叶鲜样质量
Missof~otykdoahaevery
10mL e 【yme solution(g)
图 I 黄瓜不同子叶用量对原生质体产量及存活率的影响
． I EIfd啮 ofⅧ咖 嘲 ∞Iy-ed岫 ∞ the yteId
and剐旷话而 rate ofa冀哪呻b盯 portola~ s
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报 3O卷
培养基中培养不仅难以分裂，且极易破裂，而当酶液、洗液和 KM8p中的 Ca2 浓度全调至 1 mmol／L
时，依本文分离培养程序则可获得相当高的植板率。这其中的原因可能是：1．适宜的 Ca2 浓度促进
了原生质体膜电荷的平衡。2．酶液、洗液及培养液中一致的 Ca2 浓度避免了膜电荷环境剧变对原生
质体造成的冲击。此外，改良 KM8p中丰富的植物代谢中间产物对促进原生质体的高效培养或许是同
样重要的，改 良KM8p培养基能使黄瓜原生质体在 5 000个／mL的较低密度获得再生植株，并能在 50
个／mL的密度启动多次分裂，这对于以后建立黄瓜原生质体低密度高效培养体系具有启示意义。
2．2 体胚分化及植株再生
培养物转移到固体平板 3～4周后 ，在不同培养基上出现 4种增殖分化类型：1．在去除 2，4一D，
仅附加生长素及分裂素的培养基上愈伤组织增殖较快，并在若干天内迅速转绿，但无法获得器官分
化；2．在仅含低量 2，4一D (0．01～0．2 mg／L)的培养基上愈伤组织生长较慢 ，呈浅黄色，易发生不定
根，无芽的分化；3．在有高量 2，4一D (2～4 mg／L)存在的培养基上 ，愈伤组织易增殖成松软半透明
状，转入 CIMS0培养基 (改良MS附加 2，4一D 3．5 mg／L和 6一BA 0．1 mg／L)后发生白色的体胚 (插页 2
图版，E)；4．在适量的2，4一D(0．5～1．0 mg／L)配合生长素或分裂素的培养基上增殖的愈伤组织多
呈鲜黄色，可长时间继代，亦难以获得再生植株。
在 CIMS0上发育至心形期至子叶形期的体胚近 10％，在移人去除任何生长激素的改良MS培养基
后可通过继续培养完成成熟过程并萌发成小植株。小植株移栽后经 1周的体温保湿可顺利成活并在温
室中健康生长。值得一提的是，大部分再生的体胚发育成熟较慢 ，萌芽抽茎困难。部分形态正常的再
生植株在培养瓶中极易开花结果。移植的再生植株在温室中能长时间成活，形态上表现为株形矮小，
节间粗短，叶片深绿 、小而厚硬，早花、早果的特点 (插页 2图版，F)。利用再生植株叶片气孔保卫
细胞中的叶绿体数进行染色体倍性间接推测发现，再生植株气孔保卫细胞中的叶绿体数多接近正常植
株的 4倍以上，说明再生植株多为 4倍体或多倍体。因此，原生质体再生植株染色体的多倍性将会成
为黄瓜细胞生物技术应用的一个重要影响因素。
参考文献：
1 许志宏，卫志明．植物原生质体培养和遗传操作．上海：上海科学技术出版社，1997．175～179
2 BmzaW，Malepszy S．In vitro culture of Cuaun／s sta／ms L．XⅧ Plantsfrom protoplas~tl】 direct s c∞ gelesis．Plant cel，tissue
and organ culture， 1995，41：259～266
3 杜胜利，韩毅科，魏爱民，等．黄瓜倍性鉴定方法的研究 ．园艺学报，20O2，29(3)：280～281
Efi cient Culture and Plan t Regeneration from Cotyledon Protoplasts of ‘Cui
xiu’Cucmnber
Guo Dezhang ，Yan Zhen ，1．ai Zhongxio~，Lin Qirdi ，and Wang Jiafu2
( Fuzhou Institute of~ ol Sciences Fujian Province，Fuzhou 350014，Ch／na； Institute ofSubtropical Fruit Trees。FufianAgn—
cultural and Forestry University，Fuzhou 350002，Ch／na)
Abstract：Isolated and purifed cotyledon protoplasts of cucumber(Cucumm／s sat／t~ L． ‘Cuixiu’)were
cultured at diferent population density ranging from 5．5×lO／mL to 5．5×l~／mL in mKM8p liquid medium re—
spectively an d underwent cell division in varying degrees．Sustained cel divisions with eventual somatic colony pm—
ducfion occured only when the population density of protoplasts exceeded 1．0×103／mL．the highest plating efll—
ciency was about 54％ ．IJa quantifies of embryoids diferentiated from protoplast derived ealli and then converted
into planflets after succedent induction culture．Results demonstrate that the concentration of Ca2+has an important
efect on the stability and cel division of cucumber protoplasts．
Key words：Cucumber；Cotyledon；Protop]asts；Plant regeneration
维普资讯 http://www.cqvip.com