全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(6)：683～686
A曲 Hortdcultume Sinl"ca
马铃薯花粉的超低温保存研究
王玉萍 张 峰2 王 蒂2
( 甘肃农业大学园艺系 ，兰州 730070； 甘肃农业大学农学院 ，兰州 730070)
摘 要：对影响马铃薯花粉超低温保存效果的因素进行了研究。结果表 明：冷冻前干燥处理 18 h的花
粉 ．保存后其生活力优于干燥处理 12 h和 24 h的花粉 ；用 0~C (12 h)一 一10~C (12 h)一 一20~C (12 h)
的逐步降温预冻处理，可大幅度提高在液氮中冰冻保存花粉的活力 ；保存后的花粉用 一20~C (12 h)一 4~C
(12 h)一 25℃ (12 h)逐步解冻效果最好 ，35～4J0℃直接解冻效果优 于 (25±2)℃直接解冻 ；超低温保存对
花粉萌发表现出某些促进作用。
关键词：马铃薯 ；种质 ；花粉 ；超低温保存
中图分类号 ：S 532 文献标识码 ：A 文章编号 ：0513—353X (2003)06-0683—04
超低温保存作为现代种质保存技术 ，已在 30余种植物成熟花粉的保存 中取得成功【卜引。花粉
贮藏的方法中，液氮 (一196~C)贮藏被认为是 目前实现生物种质永久保存最有效的途径而广泛应
用 ，迄今已有很多植物的花粉用液氮贮藏成功 ~3j。目前我们在开展花粉原生质体的分离工作 ，这
使花粉的保存有 了新的研究与应用价值。本试验以马铃薯花粉为材料，旨在探索提高其液氮保存效
果 。
1 材料与方法
供试材料为马铃薯 (So／anum tuberosum L．)成熟花粉，取 自 ‘甘农薯 1号’、‘甘农薯 3号’、 ‘青
薯 168’、‘下寨 65’4个优良四倍体普通栽培品种，种植于甘肃农业大学校园试验田。
脱水处理：开花当天采集新鲜成熟花粉装于冻干管中，置于盛有无水氯化钙的干燥器中干燥脱水
处理 12、18和24 h。预冻处理 ：将冻干管中干燥后的花粉，分别在 0~C恒温 (12 h)、一20~C恒温 (12
h)以及 0~C (12 h)一 一10~(2(12 h)一 一20℃ (12 h)变温预冻处理，然后立即投入液氮中，15 d
后测定花粉活力。解冻复苏 ：将保存花粉分别用 (25±2)oC水浴直接解冻、35～4o℃水浴直接解冻和
用 一20~C (12 h)一 4~C (12 h)一 25 oC (12 h)逐步解冻法进行解冻复苏。花粉活力测定采用体外萌
发法。花粉管长度≥1／2花粉粒直径的为萌发花粉。花粉活力 (萌发率 ) =萌发花粉数／观察花粉总
数 ×100％，取 10个视野的平均数。相对活力 =处理花粉的活力／初始花粉活力 ×100％。萌发液组成
为20％ ～25％蔗糖，0．01％ KNO3，0．035％ H3BO3，0．03％ CaC12·2H20，0．02％ M 04·7H20，pH 5．6
(过滤灭菌)。
2 结果与分析
2．1 干燥时间对马铃薯花粉超低温保存效果的影响
表 1的结果表 明，冷冻前 干燥 18 h的花 粉在液氮 中冷冻保存 15 d后其 相对活 力最高 ，达
105．6％。干燥时间延长，贮藏后花粉的相对活力下降。4个品种趋势一致。
收稹 日期 ：2003—02—11；修回日期 ：2003—08—03
基金项目：国家教委高等学校优秀青年教师教学和科研奖励基金项 目 (9830596)；国家高技术研究发展计划 (“863”计划)项 Et
(2001AA241 132)
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30卷
2．2 预冻对马铃薯花粉超低温保存效果的影响
表 2显示 ，马铃薯花粉在冻干管中干燥处理后，分别经 0℃恒温 (12 h)、一20℃恒温 (12 h)预
冻处理和不经预冻直接投入液氮的速冻处理，相对活力之问差异不显著，而经 0 (12 h)一 一l0℃
(12 h)一 一20℃ (12 h)逐步降温预冻处理，提高了超低温保存后花粉的活力。
表 1 干燥时间对液氮贮藏后马铃薯花粉生活力的影响
Table1 Efects ofthe desiccation-durationon storage of poUem iniqiud nitrogen (LN)
*新鲜花粉的萌发率 **花粉在 一20％ (12 h)一 4℃ (12 h)一 25％ (12 h)下逐步解冻。
*The m面 m rate offresh polen ． **Polen were defroged first at一20％ for 12 h，then 4℃ for 12 h，finally 25％ for 12 h after storage in LN
表 2 预冻对 ‘甘农薯 3号’马铃薯花粉超低温保存效果的影响
Table 2 Efect of prefreezing onthe viability of polen of‘Gannon~ u 3’storedinliqiudnitrogen(LN)
*邓肯氏新复极差测验 (P
以液氮中保存60 d的花粉为材料，比较了3 兽80
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6期 王玉萍等 ：马铃薯花粉的超低温保存研究 685
表 3 液氮中贮藏时间对花粉活力的影响
Table 3 Efects of duration of storageinliqind nitrogen(LN)on polen viability
3 讨论
花粉含水量的高低L1．2]是超低温保存成功与否的内在原因。研究发现，冷冻前干燥处理 18 h，保
存花粉的活力优于干燥处理 12 h和 24 h的花粉。可能是在投入液氮中或解冻过程中，高含水量的花
粉细胞内容易过多结冰，造成冰冻伤害 ，影响保存后的活力，但干燥时间太长 ，花粉含水量太少 (生
理缺水)也会影响保存后的活力。
花粉快速降温时易产生冰晶、4 J。本试验将花粉在 一IO~C低温贮藏 12 h再降至 一20℃低温贮藏 12 h
后投入液氮 ，这样经过干燥的花粉缓慢降温至 一20℃，有利于花粉的保护性脱水，停留 12 h可使脱水
更充分 ，不仅避免了随后快速降温时冰晶的产生，而且花粉受到了抗寒锻炼 ，增加了超低温保存效果。
本试验观察到液氮保存对花粉萌发 (活力 )有某些促进作用 ，此现象也出现在黑麦 (Seca／e ce．
reale)、5 J花粉超低温保存研究中，这种刺激的机理 目前还不清楚。
植物种质在超低温下，遗传性稳定⋯，贮藏时间较长。试验通过对液氮贮藏 15 d和 150 d的花粉
活力的研究发现，保存时间对花粉的活力几乎无影响，但投入液氮前经过不同时间干燥处理的花粉，
在贮藏后其活力变化较大。在降温与化冻过程中，花粉的某些生理特性发生了变化，当环境条件恢复
正常时 ，花粉内环境也需要有一个恢复过程才能达到保存前状态 ]。因此 ，适宜的解冻处理是冷冻保
存花粉活力恢复的必要技术环节。本试验 中逐步解冻法效果最好，35～40℃的解冻效果优于 (25±
2)℃的效果。在较低温度下解冻 ，易造成胞外结冰，使细胞双分子的脂类层破裂 ，膜失去选择透性，
致使细胞死亡。而逐步解冻复苏处理，能使保存花粉的含水量明显增加，贮藏过程中损伤的质膜得到
较好修复，使花粉处于 良好的萌发准备状态 ，提高了贮藏后花粉的萌发率。
参考文献：
1 Towill lJ E．Low temporatur and freeze一／vaccum—drying preservation of polen．In：Kartha K K．Cryopreservation of plant Cels and orgaIls．n ·
da：CRC Press． 1985． 172—198
2 Barbabas B，P~jki E Storage of maize (Zea mays L．)Polen at一196qC in hqwd nitrogen．Euphyti~，1976，25：745—752
3 陈品良，贺善安 ，金 炜 ，等 ．秤锤树花粉的超低温贮藏研究．植物学报 ，1990，32：288 291
4 Rashid A．Cel preservation．In： Cel physiology and genetics of higher plants．Florida Boca Raton： CRC Press， 1988．157～174
5 石思信 ．黑麦 (Seca／e cerea／e)花粉长期冷冻保存试验初报 ．见：马缘生主编．作物种质资源保存研究论文集．北京 ：学术书刊出
版社 ，1989．92—95
6 Withers L A． Cryopreservation and storage of germplasm In： Dixon R A．Plant Ce l Culture： A practical approach． Berlin： Springer-Verlag，
l985． 169～l9l
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园 艺 学 报 30卷
The Cryopreservation of Potato PoHen
Wang Yuping ， Zhang Feng2
， and Wan g Di
( D,raame~ of Horticulture，CrolSlZ Agricmurd { ， ， ou 730070，China； Colege ofAgronomy，Cro1~lz Agric~urd
Urao~ay， 叽 u 730070，China)
Abstract：The factors of afecting the viability of potato (Solanum tuberosum)polen stored in liqiud
nitrogen(LN)were investigated in order to improve cuopmse~ation effect．The msuhs indicated that desiccation
duration of 18 h and pre．freezing treatment at varied tempomtum of 0cI二 (12 h) 一10cI二 (12 h) 一20cI二
(12 h)can greatly increase the viability of polen stored in LN before thrown into LN．111e method of step by step
defrozen of一20oC (12 h)一 4oC (12 h)一 25oC (12 h)is beter than that of defrozing polen directly in 35
— 4ocI二or in (25±2)℃ ；The cuopmse~ation enhances polen germination of some varieties．
Key words： Germplasm； Potato； Polen；Cryopreservation
脱毒砧木 Mirabolano 29C无性繁殖初探
李洪雯 陈克玲 刘建军 (四川省农业科学院园艺研究所，成都610066)
Stmlies on the in Vitro Tissue CIllture of M irabolano 29C
Li Hongwen，Chen Keling，and Liu Jianjun (Horticu／ture Research Institute，Sichuan Academy ofAgricu／tura／Sc／em~s，
Chengdu 610066，China)
关键词 ：果树 ；砧木 ；离体培养
中图分类号 ：S 66 文献标识码 ：A 文章编号 ：0513—353X (2003)06-0686-01
Mirabolano 29C(Prurms cerns~fura)原产美国加州 Gregory Bros．Nursery，是欧美地区广泛用于李、杏等核果类果树的
优良砧木 ，能抗根癌病和线虫。21302年从意大利引进 Mirabolano 29C脱 毒苗第一代进行无性快繁试 验。 (1)以 MS、
MS-R、G、L、F14共 5种培养基进行研究。MS-R：除 NH4NO3、KNO3 为 MS 的 1／4，其余所有元素 同 MS；G、L的微量
元素 、铁盐及有机成分同 MS；G：KH2PO4 500(哗 ·L～，单位下 同)、MgSO4·7 H2O 440、 (NH4)2SO4 160、KN03 3000、
C ·2142O 220；L：KH2PO4 270、Mf~O4·7 H20 360、NH4NO3 400、KNO3 1800、Ca(NO3)2。4H20 1200；F14：NH4NO3 、
KN03同 L，ZnSO4·7 H20、NazMo04·2H20、CuS04·5 H20、CoCl2·6H20及肌醇同 MS， B03、VB1、VB6为 MS的 2倍 ，
KH2FO4 360、NaFe-EDTA 20、MnSO4·4H’o 2．5、甘氨酸 10。 (2)在相对较好 的培养基基础上设置激素配 比，附加水解
酪蛋白 (CH)、活性炭 (AC)，对试管苗作增殖 、壮苗 、生根研究。 (3)以芽在茎段生端为短茎外植体 (带 1～2芽)
进行继代增殖培养 ：G+6-BA 1．5+NAA 0．2；以单枝为外植体进行壮 苗培 养：G+6-BA 0．5+KT 0．1+NAA 0．1+CH
500，生根培养：1／2G (大量元素减半 ，VB 增加 5倍) +IBA 0．5+6-BA 0．1+AC 400；培养基 中加入蔗糖 3％、琼脂
0．65％，pH 5．7。光照 14 h·d一，光照度 2000 lx，温度 (25±1)oC。每处理 15枝 (株)。
结果表明，单株外植体在基本培养基 G中第 2～4周长势相对最好 ，几乎无褐化枯萎及黄化现象 ，其余 4种培养
基中均有 2～5单株出现不同程度 的褐化枯萎及黄化现象 ；MS 、MS-R、F14中单株长势相对较弱 ，L中长势一般。
以 NAA 0．2，当 6-BA为 1．5左右时 ．继代增殖培养第 2周短茎外植体开始分化出小芽，第 4周增殖较多 (4～7
芽)，单枝生长势及整齐度均较好 ，叶色绿；当6-BA~>2．0时 ，2周开始分化出小芽 ，第 4周增殖较 多，但丛芽矮小，
单枝生长势及整齐度均较差，部分出现褐化及玻璃化现象；当6-BA~<1．0时增殖率大大降低。
当加入附加物 CH 300～500时，2周后壮苗作用 (单枝长势)明显高于对照 (CH为 0)。CH>550时 ，随 CH浓度
增加，壮苗作用降低 ，甚至出现黄化。AC 300—500对外植体生根有促进作用，培养 3～4周后生根量及粗度高于对照
(AC为 0)；AC>600时与对照 (AC为 0)差异不明显。
经过6代左右继代培养，部分外植体会出现黄化，一方面可能是基本培养基、激素配比及附加物添加量需进一步
优化，另一方面可能是材料本身只能连续继代 6次左右 ，还需进一步研究。
收稿日期 ：2O03—06—20；修回日期 ：2003—09—19
基金项目：四川省 “十五”农作物育种攻关项 目 (2001080114)
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