全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (5) : 694～696
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 12 - 17 ; 修回日期 : 2004 - 07 - 23
基金项目 : 福建省重大科技项目 (99 - I - 1) ; 福建省自然科学基金项目 (C0410040)
球根海棠离体培养的形态发生研究
刘福平　苏明华　章　宁　林清洪
(福建省亚热带植物研究所 , 厦门 361006)
摘 　要 : 球根海棠外植体可在同一条件下同时诱导不定芽和胚状体 , 经间接途径和直接途径的体细胞
胚胎发生频率均很高 , 体细胞胚为单细胞起源或多细胞起源。以再生嫩叶为继代中间体 , 在较高温度
(28 ℃) 下诱导 , 可建立高效扩繁体系。纵切芽丛继代形成大量愈伤组织 , 愈伤组织继代半年后几乎完全丧
失分化能力 , 发生激素驯化作用 , 而且愈伤组织细胞染色体数目已发生广泛变异。
关键词 : 球根海棠 ; 体细胞胚胎发生 ; 再生体系 ; 继代愈伤组织
中图分类号 : S 68 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0520694203
In Vitro Morphogenesis of Begonia tuberhybrida
Liu Fuping , Su Minghua , Zhang Ning , and Lin Qinghong
( Fujian Institute of S ubt ropical Botany , Xiamen 361006 , China)
Abstract : Organogenesis and somatic embryogenesis of Begonia t uberhybrida could carry out on the same
culture conditions. Somatic embryos occurred f rom explant directly or indirectly and originated f rom single2cell
or multi2cell. At higher induce temperature (28 ℃) , subculturing regenerated young leaf could establish high
efficient regenerate system. Through subculturing cluster of buds , a large amount of callus formed , and the
callus subcultured for half a year lost almostly differential ability. Observation showed callus was habituated by
growth substance and there were wide2ranging variation in the number of chromosome in cells of the callus.
Key words : Begonia t uberhybrida ; Somatic embryogenesis ; Regenerate system ; Subculture callus
1 　目的、材料与方法
关于四季海棠 ( Begonia sem perf lorens)〔1〕、毛叶海棠 ( B1 cathayana)〔2〕、丽格海棠 ( B 1 ×Ela2
t ior)〔3〕体细胞胚胎的发生已有一些报道。作者在球根海棠 ( B 1 t uberhybri da Voss. ) 离体培养中发现
体细胞胚胎发生频率很高 , 方式多种多样 , 开展其形态发生研究具有一定的理论意义和应用价值。
将球根海棠种子在无激素 MS 培养基上培养 , 得到实生苗。切割叶柄、叶片作外植体 , 在温度
28 ℃或 22 ℃下诱导 , 光照 1200 lx , 每天 12 h。诱导、继代培养基同为 : (1) MS + NAA 011 mg/ L
(以下单位同) + BA 015 ; (2) MS + NAA 012 + BA 210 ; (3) MS + NAA 011 + BA 310 ; (4) MS +
NAA 0105 + BA 0125。愈伤组织继代半年后降低或去除培养基中生长调节剂 : ①MS + NAA 0105 +
BA 015 ; ②MS + BA 015 ; ③MS + BA 012 ; ④MS + NAA 0105 ; ⑤MS + NAA 011 ; ⑥MS ; ⑦用
原继代培养基于 12 ℃培养 10 d 后 25 ℃培养 ; ⑧原继代培养基上暗培养 10 d 后恢复 1200 lx 光照。取
表面有分化“芽点”的外植体、愈伤组织做常规石蜡切片 , 显微观察形态发生。幼胚、芽活体观察维
管束 ; 初代愈伤组织、继代半年愈伤组织常规压片 , 检查染色体数目。
2 　结果分析与讨论
211 　器官发生与体细胞胚胎发生
不定芽与体细胞胚在同一条件下同时发生的报道很少。显微观察表明 : 球根海棠不定芽维管束从
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愈伤组织延伸出来 , 即器官发生 (图版 , 1) , 不定胚维管束独立 , 不与愈伤组织相连 , 即经体细胞胚
胎发生 , 不定胚与不定芽在外观上也明显不同 (图版 , 2) 。由于大多数植物以 2042D 诱导胚状体 , 而
球根海棠则可以 NAA 诱导体细胞胚 , 不定芽诱导能在相当广的外源激素范围进行〔4〕, 因此 , 应用同
一培养基就有利于兼顾不定芽和胚状体发生途径。马国华等〔5〕也发现 NAA 能诱导木薯嫩叶直接体细
胞胚胎发生和不定芽形成 , 其它几类生长素类化合物如 2042D、Dicamba 等只能直接诱导体细胞胚胎
发生。诱导培养基 (2) 细胞分裂素与生长素比值较低 , 从外植体上分化的几乎都是胚状体 ; 反之 ,
(1) 、(3) 培养基不定芽与胚状体的数量比例为 1∶1～5。球根海棠体细胞胚胎发生的间接途径 (从愈
伤组织分化 , 图版 , 2) 和直接途径 (从外植体发生 , 图版 , 3、4) 发生频率均很高 , 目前直接途径
报道的植物种类不多 , 主要从子叶、幼胚、下胚轴、叶片 (包括毛叶海棠、丽格海棠等) 发生 , 图
版 , 4 显示由嫩叶柄直接发生。图版 , 5 示单个胚性细胞不均等分裂成三细胞原胚 , 图版 , 6 示胚柄
由纵向单列细胞构成 , 是单细胞起源的结果〔6〕。图版 , 7 示叶表皮多个胚性细胞共同起源 , 发育成原
胚 (图版 , 8) 。试验中普遍发现在诱导的多细胞原胚、成熟体胚及不定芽上均可从表面直接萌发许多
次级原胚 (图版 , 9～11) , 具有典型的胚体和胚柄 , 决非表皮毛 (秋海棠表皮毛为单细胞结构) , 未
观察到这种结构的进一步发育。在某些植物组织培养中诱导体细胞胚发生 , 如不及时降低 2 , 42D 浓
度 , 球形胚就产生次生胚 , 形成球形胚链 , 体细胞胚的正常发育被抑制〔7〕。本研究中无须降低外源
生长素 , 一级胚 (母体胚) 仍可发育成熟。
212 　离体培养高效再生体系的建立
球根海棠外植体在较低温度 (22 ℃) 下培养愈伤组织诱导率几乎为 100 % , 随后很快发芽 , 出芽
率 90 %以上 , 在较高温度 (28 ℃) 下培养几乎所有外植体直接出芽 , 但高温对随后的芽生长有抑制
作用 , 最好转入 25 ℃下生长。叶片、叶柄在培养基 (1) 、(2) 、(3) 上诱导出芽状况几乎相同 , 即有
较广的生长调节剂适用范围。叶柄与叶片的诱导情况无明显差别 , 降低生长调节剂的培养基 (4) 或
诱导期的前 10 d 暗培养的诱导效果较差 , 但叶柄的愈伤组织诱导率、出芽率均比叶片高 , 即叶柄比
叶片对培养条件要求相对低一些。
秋海棠属植物离体繁殖一般以嫩叶为外植体 , 叶面出现小芽丛切割继代繁殖。作者以该方式用继
代培养基 (1 )～ (3) , 虽然在 28 ℃下继代三四次后 , 外植体衍生的愈伤组织已将外植体完全包埋 , 芽
从愈伤组织表面分化 , 不得不以愈伤组织作继代中间体。新切割的小块愈伤组织于继代培养基 (1) 、
(2) 经 20 d 恢复培养 , 生物量可增加 6 倍 , 再过 25～30 d 分化芽 10 个左右。切割愈伤组织继代持续
3 个月后随着继代次数增加 , 分化能力逐渐降低 , 再过 3 个月几乎完全丧失。如以实生苗的叶片为外
植体 28 ℃诱导直接出芽 , 得 2 cm 高苗时切割下来作继代中间体 , 45～50 d 后每枚叶片外植体可得 2
cm 高芽苗近 20 株 , 叶子 60 余枚 , 即 45～50 d 增殖系数约 60 , 而愈伤组织作继代中间体 40 d 增殖系
数为 36 , 日均增殖数明显较低。此外 , 以嫩叶作继代中间体半年后仍未见增殖系数明显降低。
213 　长期继代愈伤组织分化潜力丧失的初步研究
球根海棠愈伤组织继代半年后形态发生潜力几乎完全丧失。涉及本质的解释有 : 一为细胞变异 ,
镜检初代愈伤组织半数细胞染色体数为 42 ±2 条 , 与实生苗茎尖细胞染色体数接近 , 而丧失分化能力
的愈伤组织细胞染色体数据十分分散 , 分别为 27、30、35、36、36、38、40、40、44、46 条 (图 12
示 35 条) 。二为细胞或组织对激素发生驯化作用 (habituation) , 可以降低 (或去除) 外源生长调节物质、
低温刺激 (对内源生长调节物质影响) 、应用抗生长素等来恢复细胞分化潜力〔8〕。随着球根海棠继代次
数增加愈伤组织呈疏松、半透明水浸状 , 所分化芽苗叶粗厚变脆。切割该芽苗接入继代培养基 , 外植体
急骤膨大 , 即使在 28 ℃下也易于诱导出愈伤组织 , 均为激素 (生长素或细胞分裂素) 过量症状〔4〕。将继
代半年的愈伤组织分别转入降低或去除生长调节剂培养基 (处理①～⑥) 、低温刺激 (处理⑦) 、黑暗中
培养均无法恢复分化能力。所以长期继代愈伤组织形态发生潜力丧失是遗传因素与生理因素共同作用的
结果。该试验还证明了以嫩叶作继代中间体的直接再生方式可避开愈伤组织细胞变异。
596　5 期 刘福平等 : 球根海棠离体培养的形态发生研究 　
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参考文献 :
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图版说明 : 1. 不定芽 , 维管束与愈伤组织连接 , ×9 ; 2. 胚状体维管束独立 , ×8 ; 3. 由叶片诱导的丛生胚状体 , ×8 ; 4. 嫩叶柄
直接萌发原胚 , ×22 ; 5. 单个胚性细胞分裂得三细胞原胚 , ×150 ; 6. 原胚的胚柄由单列细胞构成 , ×150 ; 7. 多个胚性细胞共同
发育 , ×150 ; 8. 原胚与愈伤组织广泛连接 , 为多细胞起源 , ×23 ; 9. 球形原胚表面萌生次级原胚 , ×22 ; 10. 胚状体表面密生球
形原胚 (箭头) , ×20 ; 11. 图 10 局部放大 , 示胚状体表面直接萌生多细胞原胚 (箭头) , ×90 ; 12. 非胚性愈伤组织细胞染色体 35
条 , ×570。
Explantation of plates : 1. Adventitious bud , showing the connection between vascular system of bud and mother tissue. ×9 ; 2. No connec2
tion between the vascular system of embryoid and mother tissue. ×8 ; 3. Multiple embryoids on leaf segment . ×8 ; 4. Proembryos
originated directly on young stem segment . ×22 ; 5. Tri2cell proembryo divided from signgle embryonic cell. ×150 ; 6. Suspensor of embry2
oid consisted of signal line of cells. ×150 ; 7. A cluster embryonic cell developed together. ×150 ; 8. Proembryonic body broadly attached
with callus , multicellular initiation. ×23 ; 9. Secondary proembryo germinated directly on the surface of the globular2sharped embryoid. ×
22 ; 10. Proembryos (arrow) were distributed brickly over mature embryoid. ×20 ; 11. The enlargement of part of plate 10 , showing the
proembryo (arrow) germinated directly on the surface of embryoid. ×90 ; 12. The number of chrosomes in cell of non2 embryogenic callus
was 35. ×570.
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