全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(4)：487～491
Aeta Horticulturae Slmba
兰花组织培养及分子生物学研究进展
范成明 李枝林2 何月秋
( 云南农业大学植物保护学院，昆明 650201； 云南农业大学园林园艺学院，昆明 650201)
摘 要：就兰花的根、茎 、叶、花和种子等方面的组织培养效率及外界条件的影响作简要综述，介绍
分子生物学技术用于兰花遗传多样性 、分类 、基因克隆和遗传改造等方面的研究进展。
关键词：兰花；组织培养 ；分子生物学
中图分类号：S 68 文献标识码 -A 文章编号：0513．353X (2003)04-0487—05
兰花是整个兰科植物 (0rchidaceae)的总称 ，全世界约有 730多属 ，21 500多种，广泛分布于全
球各地，但主要分布在热带、亚热带地区。我国约有 173余属，1 240余种，在南北各地均有分布，
但以云南、台湾、海南最为丰富。
1 兰花组织培养研究进展
兰花的传统繁殖方式为分株繁殖，繁殖系数低 、速度慢 ，不能满足 日益增长的市场需求。兰花的
组织培养始于 20世纪 60年代，Morel[ J采用大花蕙兰的茎尖，将其分生组织诱导形成原球茎并分化成
植株，为实现兰花生产的工厂化奠定了基础。兰花的组织培养中有几个关键的时期 ：原球茎的诱导、
原球茎的继代培养 (根状茎)、壮苗的培育。根据这几个重要的时期及在其间组织培养的外界条件，
人们对兰花组织培养进行了广泛的研究。
1．1 原球茎的来源及增殖
除茎尖 、叶片和种子外 ，花瓣、萼片、子房、花梗【1,23、侧芽 j、花芽、茎段、根尖等外植体也
成为兰花组织培养中原球茎的重要来源。
从前，植物学家认为根分生组织转化为芽体的可能性极小，但 Stewart等用树兰 ( 九肌)等
的根开创性地培养出了原球茎和从愈伤组织分化出 1株苗 j。此后，根的培养相继在不同兰花中获得
了成功[4-7j。徐宏英等用大花蕙兰的幼根成功地进行组织培养 ，来检测其快速繁殖的影响因素 J。
茎尖是最早用于兰花快速繁殖的外植体，侧芽应用也相当广泛。但对一些单茎性兰花，如利蝴蝶
兰 (Phalaeanopsis)、仙指甲兰 (Aerides)等用茎尖作为外植体有可能丧失母株，人们倾向于寻找其他
可能的外植体；茎尖作为外植体较适于复茎性兰花，如大花蕙兰 (Cymbidium)、卡特丽亚兰
(Catleya)、石斛兰 (Dendrobium)、文心兰 (Oncidium )等，且学者们对茎尖及侧芽的取材时间、最适
取材部位及大小进行了深入的研究，一般认为带 1—2个叶原基的茎圆锥成活率高，中间部位侧芽的
成活率及生长率较高。Sewert等曾报道获得了兜兰 (Paphiopedium)的组培苗 j，但此后相关报道很
少。
叶片作为外植体既可减少对母株的伤害，取材又不受季节的限制 ，且数量多，是比较理想的外植
体材料来源。不过，以试管苗的幼叶作为外植体培养较好，成熟幼叶对诱导反应极弱 ．1。。，这可能是
由于成熟植物组织向培养基中释放高浓度抑制生长的物质，严重影响兰花的存活u 。但肾药兰成熟
植株最上面 3片幼叶在培养中却显示出较强的增殖能力，在 10～12周内基部分化出芽，但不产生原
收稿日期：2002一l1—26；修回日期：2003—03—17
基金项目：国家自然科学基金项目 (2002C002T)；云南省科学基金重点项 目 (30160074)
*通讯作者：Heyueqiu@163．com
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球茎；Chen等从幼叶的叶尖表皮细胞和叶肉细胞直接培养出体细胞胚，但在 1个月之内无愈伤组织
产生，在经过下一级的培养后分化出幼苗ll 。
兰花的种子用于组织培养极富前景。在自然条件下兰花种子虽多 (一个荚果约能产生 104～106粒
种子)，但由于其不具有发育完全的胚，很难萌发。LinI【 ]早在 1824年就观察到在自然条件下兰花种
子萌发伴随着真菌感染的现象。Noel Bemared在 1899年首次认识到真菌的作用，认为真菌对种子的侵
染是种子正常萌发必需的，种子与真菌之间是一种共生关系，由此创立了共生萌发法ll驯。随着对共
生萌发机制的研究，人们发现大部分兰花种子可以通过无菌萌发的方式进行，即非共生萌发。Bernard
以 Ophrys L．的块茎配制的培养基，使卡德丽亚兰与蕾丽亚兰杂交种子成功萌发，开创了非共生萌发
的先例【 ]。随后，研究者用非共生萌发也对其他兰花的种子进行萌发研究，如齿瓣兰、蝴蝶兰、石
斛兰、文心兰等【1引。之后，非共生萌发逐步代替了共生萌发，成为兰花组织培养的热点。相关资料
显示 ，有些兰花的未成熟或接近成熟的种子比成熟的种子更容易萌发l 。兰花种子在自然条件下萌
发困难 ，除了胚发育不完全外，与种皮致密、透性差或种皮中含有抑制物有关。田梅生等ll8j用剪刀
将四季兰种皮剪破后种子的萌发率大大提高；有人用超声波法等物理方法对种皮进行处理都不同程度
提高了萌发率；段金玉等对兰属 1O种植物的种子离体萌发研究时发现，用 0．1 moL／L氢氧化钠浸泡多
花兰、朵朵香、双飞燕、豆瓣绿、寒兰、套叶兰等 10～30 min，萌发率可提高 10倍以上H9】。风兰的
成熟种子用肥皂水洗净后，用 70％的酒精浸泡 3O s，利于萌发 ]。这些预处理效果的生理机制还有
待进一步研究。大部分兰花的种子，可以通过无菌萌发的方式进行萌发，附生或半附生兰和气生兰及
杂交后代的种子萌发较易，而地生兰种子的萌发较难。
1．2 培养基及外界条件的研究
目前 ，在兰花的组织培养中，最常用的培养基为 MS、VW、Knudson C、Kyoto、 te和它们的改
良型，应根据不同品种而选择合适的培养基，如春兰要求培养基中的无机盐量要少，蕙兰要求的量较
大，而墨兰则不敏感l2 。
目前常使用的外源激素主要是生长素类 (如 L 、2，4一D和 NAA)和细胞分裂素类 (如 BA、ZT
和 KT)。对不同的兰花来说 ，在不同的生长发育阶段所需激素的量和种类都不尽相同。Kusmr~to报道
2，4一D、KT、GAs+NAA有助于兰属杂交种原球茎的生长，2，4 D+GAs有利于芽的生长，GAs+NAA
有利根的形成(z2]。Paek~23J发现 NAA和 KT能促进兰属原球茎的生长。陈丽等在对墨兰的研究中发现
0．5 mg／L NAA+1．0 mg／L BA有利于墨兰根状茎的增殖【 ¨。
蔗糖作为培养基的能源物质和渗透调节剂，对原球茎的生长影响较大，不同浓度对兰花组培的作
用不同。2％的蔗糖有利于兰属原球茎的最好生长【驯；2％ ～3％的蔗糖促进芽的形成，而根的分化和
生长则以5％蔗糖最适合 ；1．O％～1．5％的蔗糖利于墨兰原球茎的快速生长，长期培养可适当加大
蔗糖的浓度 。
pH值影响细胞的透性 、代谢和培养物生长、分化。从试验资料来看，原球茎在 pH 5．0～5．4的
环境中生长最好，过酸或近中性的环境都不合适l2¨。
兰花外植体易分泌酚类物质，引起褐变，不利于组织培养，活性炭可以有效的吸附酚类物质，从
而减少褐变L21 J。
切割方式对原球茎的繁殖系数也有影响，一般认为掰开方式最有利于原球茎的生长，横切次之，
纵切效果最差。但有人认为杂种兰原球茎纵切有利于苗的形成C26]，这可能与品种有关。
2 兰花分子生物学研究进展
兰科植物对根癌农杆菌或发根农杆菌不敏感，缺乏合适的载体，基因工程起步较晚，进展缓
慢[ 。
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4期 范成明等：兰花组织培养及分子生物学研究进展
2．1 分类方面的研究
由于兰花属间自然杂交及属内变种、品种以及 自然杂交种的存在 ，仅凭形态特征较难分类[ 。
我国学者利用同工酶技术和 RAPD技术对中国兰花的品种或变种进行鉴定和分类，得到的结果与传统
的形态学分类基本相似 。Soliva等利用系统发生学分析的方法，依据 qoh,y的核糖体 DNA和叶
绿体 DNA的序列，认为 Oph~y应该分成两个类群，这与以前的分类相矛盾，且推测这种情况可能是
该兰花系谱受到近期辐射的结果【3引。许多学者从兰花的 cDNA文库中筛选到了许多多态微卫星位点，
并利用这些多态微卫星位点分析品种间的遗传差异。
2．2 基因组方面的研究
2．2．1 特异基因的研究 近几年从兰花的不同组织中获得了许多基因和基因相关片段[34’4 2】。利用同
源探针的方法 ，花色素的主要色素之一查尔酮的全长 cDNA得到了其基 因克隆，其中有 3个克隆
OCHS3、OCHS4、OCHS8的序列已被测定，研究表明，所有 cDNA克隆都含有 1个 1 185 bp的开放阅
读框 。
很多学者对兰花花期的核酸变化进行了大量研究，并成功地得到了许多基因和基因片段。Yu等
提取了石斛兰 (Dendrobium madame Thong-In)花期和营养期的茎尖分生组织中的总 RNA，利用 RNA差
异显示的方法，发现在营养阶段有 53个差异表达的cDNA克隆，而在花期有 l6个专化性表达的 cDNA
片段，在转录的基础上，进行 Northern blot分析证实 l2种 cDNA是减少的，而 8种 cDNA是增加的，
且序列分析表明有5个克隆是转录因子【3引。Yu等从兰花转化期茎尖分生组织 (TSAMS)得到 gene7
(otg7)并用 其 为探 针，从 TSAMS的 cDNA文 库 中分 离 出 了 3个 MADS．box基 因 (DOMADS1、
DOMADS2、DOMADS3)。研究还表明，DOMADS基因在兰花的花期起着重要作用[36J。Bui[驯和 H0[勰]
等在蝴蝶兰中克隆到了 1一氨环丙基 一1一羧酯 (1．aminocyclopropane．1．carboxylate)合成酶基因 (P ．
ACS1、Phal—ACS2、Phal—ACS3)，这几个基因主要是在兰花不同的时期调节乙烯的合成，为兰花花期
的改造提供了遗传学依据。
Pelegrino等从广泛分布于地中海地区的一种兰花 (Serapsias vomeracea)的文库中得到微卫星位点
并对 l8个位点进行引物设计，筛选到了6个位点的引物，发现这 6个位点的等位基因数量为 3 6
个，杂合率在0．35—0．86之间变化，表现出较高的变异水平【4 ；Gustafsson等在兰花 ( n口如n
conopsea)的两个基因组文库中发现了6个多态性微卫星位点，且呈较高水平变异 ]。在兰花 (Orch／d
pa／ustr／s)叶绿体基因组研究中，发现了 1个衔接重复子 (即小卫星位点)，该重复单元是 1个在叶绿
体 tRNA基因内区上 l6 bp的富含AT的序列，且序列大小在不同地区来源的同种兰花中存在差异，可
能作为分子标记用于群体遗传研究【45]。
2．2．2 基因的改造 人们还采用物理、化学、生物学等方法进行兰花基因组改造。有报道，以春兰
种子和茎尖为外植体进行组织培养 ，形成原球茎后 ，用紫外光和秋水仙素进行人工诱变，得到了变异
植株 ]。用粒子轰击法【钾埘]，如 Yang等利用粒子轰击的方法将含有 GUS-INT和 基因转入到
兰花的原球茎中，并获正常表达和得到转基因的兰花苗【47 ；有人将 bar基因转入到 3个属 (Brassia、
Catleya和Doritiaenopsis)兰花并获得了功能表达 ；用基因枪法【50．对原球茎进行遗传操作，也获得
了大量变异细胞。
通过与根癌农杆菌协同培养法(51,52]，将外源 DNA插入到兰花基因组中，能引起幼苗变异。如
Yu ¨ 等将含有 DOH1基因土壤杆菌 LBA4404接种到原球茎的薄切片上并进行共同培养，DOH1基因
能在组培苗中表达，形成了不正常的多态茎植株，表明 DOH1基因调节兰花植株的形态 ，这将为利用
基因工程技术来修饰兰花形态打下基础。
3 展望
随着兰花产业的发展，利用组培技术培育无毒兰[ 引，将是今后兰花组培的另一个发展方向。目
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前人们对兰花共生菌的研究进展缓慢。为了提高兰花种子的萌发率 ，深入研究兰花共生菌根及应用将
是今后的一个重要研究课题。
更值得一提的是，根癌农杆菌成功地导入到了兰花的基因组中，这将大大推动兰花分子生物学研
究。在分子生物学和组织培养研究的基础上，开展兰花的多条途径的综合育种，尤其是开展种间属间
杂交结合染色体加倍而形成的异源四倍体具有十分诱人的利用前景 引。
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Advances on 0rchid Tissue Clllture and M olecular Bi
Fan Chengming ， Li Zhilin2，and He Yueqiu
(。Plant Protection College，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，Ch／na； of Gardening and 如腮，
Yunnan Agricultural Unitenity，Kunming 650201，Ch／na)
Abstract：The eficiency of orchid tissue culture through root， stalk， leaf， flower and seed an d the influence
of the exoteric environments on the tissue culture aIe briefly summarized an d the molecular biology used for genetic
diversity，taxonomy， gene cloning and genetic modification of orchid is evaluated in this review．
Key words：Orchid； Tissue culture；Molecular biology
l l illil暖
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