全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(2)：193～198
Acta Holticuhurae Sinica ． ． ． ．．． ．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．— —
大白菜的马铃薯蛋白酶抑制剂基因转化及抗菜青虫
性的鉴定
张军杰 ， 刘 凡 罗 晨 姚 磊 赵 泓 黄玉碧
( 四川农业大学，雅安625014； 北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100089； 北京市农林科学院植物保护与环
境保护研究所，北京 100089)
摘 要：以大白菜 (B．campestris ssp．pekinensis)‘北京80号’生长3 d无菌苗的带柄子叶为外植体，
通过根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法导人马铃薯蛋白酶抑制剂基因 (pinⅡ)。通过抗
性株的真叶在不定芽诱导培养基上的再生， 证实了嵌合体的存在，并通过此方法来消除嵌合体。获得的转
基因植株经PCR、PCR—Southern杂交以及植物基因组Southern杂交证实，目的基因已经整合入植物基因组
中。对菜青虫 (P／er／s rapae L．) 进行了转基因大白菜叶片的连续离体饲喂，结果表明：受试的转基因大
白菜对菜青虫的生长发育有较明显的抑制作用。
关键词：大白菜；菜青虫；害虫抗性；马铃薯蛋白酶抑制剂基因；嵌合体
中图分类号：S 634．1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)02-0193-06
Genetic Transformation of Chinese Cabbage with a Inducible Potato p／n fl Ge ne
and the Bioassay for P／eds rapae L．Resistance
Zhang Junjie ，Liu Fan ，Luo Chen ，Yao i ，Zhao Hong ，and Huang Yubi。
(。Swhuan Agricultural University，Ya’an 625014，China； B ng Vegetable Research Center，& ng 100089，China； Plant Pro-
tection and Environment Protection Insthute ofBeiji,~Agric~tural Academy，8eiji~ 100089，China)
Abstract：Cotyledons with petiole from aseptic seedlings of Chinese cabbage(B．campestris ssp．
pekinensis，cuhivar‘Beijing 80’)were used as explants for in vitro transformation using Agrobacterium
tumefaciens C58 carring plamid pBBBasta-pinlI-bar．Via series concentration selection of PPr．the trans-
genic resistant plants were got，and showed high Basta resistance when transplanted to the greenhouse． It
was proved that by shoot regeneration from young leaf disc of the survived regenerated plant，the chimera sta-
tus of the plants can be eliminated． Transgenic plants were confirm ed by PCR，PCR-Southern，and genomic
Southern bloting which showed that the bar and pin I1 genes were CO-integrated into the plant genome．Con-
tinuous insect feeding trials using larvae of Pieris rapae L．revealed that larvae fed with transgenic leaf tissue
had a higher mortality，and the developments of them were retarded compared with those larvae fed with non-
transgenic control plants．
Key words：B． campestris ssp．pekinensis；Pieris rapae L．； Insect resistance；Proteinase inhibitor
gene(pin I1)；Chimera
采用基因工程导入抗虫基因来提高作物的抗虫性，目前已有不少成功报道 引，有的已经进入生
产应用阶段。关于大白菜的转基因研究，目前建立在组织培养基础上的离体转化系统已有一些报
道 ，但总的来看，其转化频率仍然比较低，属于难于转化的植物 l5． 。马铃薯蛋白酶抑制剂基
(pin I)抗虫性范围广 ，对鳞翅目、鞘翅目和直翅目等昆虫都具有杀伤作用 ．6]。本研究应用
杆菌介导的叶盘法成功地将pinⅡ基因导入大白菜栽培品种中，获得了经分子生物学验证的转基因
收稿 日期 ：2003—06—09；修回日期：2003—09—05
基金项目：北京市高技术实验室科研合同项目 (953850100)
因 农
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植株，并对转基因植株当代进行了菜青虫 (Pieris rapae【J．)的连续饲喂试验。
1 材料与方法
1．1 外植体与培养条件
供试大白菜为栽培品种 ‘北京 80号’(北京市农林科学院蔬菜研究中心 )，其种子用纱布
包好，先用70％乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗1次，然后用0．1％ HgC1：溶液消毒1 5 min，不时摇
动 ，最后用无菌水冲洗 3次，接种于 100 mL三角瓶 中 MS培养基上萌发 (每瓶 25～30 mL MS
培养基，接种 12粒种子)，3 d后切取无菌苗的子叶一子叶柄 (带 1～2 nlIl子叶柄)为外植体
进行转化。
无菌苗生长培养基为 MS基本培养基 (琼脂0．7％ ～0．8％)；转化培养基 (液体)为MS+BA
(6一苄基腺嘌呤)2 mg／L+NAA(萘乙酸)1 mg／L+AS(乙酰丁香酮)100 txmol／L，pH 5．2；共培
养培养基为MS+BA 2 mg／L+NAA 1 mg／L+AS 100 Ixmol／L，pH 5．2，琼脂0．8％；不定芽诱导培养
基为MS+BA 2 mg／L+NAA 1 mg／L+AgNO 4 mg／L+Cb(羧苄青霉素)300 mg／L+PPT(膦丝菌素)
3．5 rag／L，pH 5．8，琼脂 1．0％；选择培养基为MS+NAA 0．01 mg／L+BA 0．02 rag／L+Cb 100 rag／L
+PPT 6 mg／L，pH 5．8，琼脂 1．0％；生根培养基为MS+NAA 0．01 mg／L+P町 7 mg／L，pH 5．8，琼
脂 1．0％。以上所有培养基均为 115℃高压灭菌20 min后，待温度至 50～60~(2时，再根据需要加入经
过滤灭菌的AS、Cb、AgNO，、P 等试剂。接种在培养皿或三角瓶中的植物材料均置于25～28~(2培
养室，共培养在弱光下进行，其余在正常光照 (约1600 lx)下进行。
1．2 菌株和质粒
所用的根癌农杆菌株系为 “C ”，含双元质
粒载体pBBBasta-pin 1I(本实验室构建，结构如
图1所示)。其中 pBBBasta载体为法国农科院
Robaglia博士馈赠；pin 1I基因的编码序列 DNA以
及马铃薯的伤口诱导型启动子及终止子为美国康
乃尔大学吴瑞教授馈赠。选择标记基因为 bar，介
导转基因株对除草剂 Basta中有效成分膦丝菌素
(Phosphinothricin，PPT)的抗性。
1．3 转化方法
取一70~(2保存的200 ILL菌液于5 mL LB培养
液中 (Km浓度为75 mg／L)，28~(2振荡过夜培养，
从新鲜的菌液中再取800～1000 ILL菌液于3()mI．
LB培养液中 (Km浓度为75 mg／L)，28％振荡培
养直至菌液的 O．D60为0．8～1．0，3500～4000 l，／
min离心10 min，弃上清液，用30 mL的转化培
养基重新悬浮沉淀，备用。
PsII
ECO
图 1 pBBBasta-pin 1质粒图
， ， Ⅱ一CR为马铃薯胰蛋白嘛抑制刺基 编码吩列，PitⅡ5’和
， ， 1 3’为该基因的启动子和终止子，RACI5’为内含子
Fig． 1 The map of plasmid pBBBasta-pin1
Pin 1-CR，Pin 1 5’ and Pin 1 3’represent separately the
将切好的外植体浸入准备好的农杆菌菌液中， u ode “and“ promoter and
侵染15 min，取出外植体，用无菌滤纸吸去多余菌液，然后把子叶柄插入共培养基中培养3 d(25 oC，
暗培养箱)，再转入不定芽诱导培养基上培养4～6周。待外植体长出不定芽后转人选择培养基上进
行筛选，待不定芽生长正常后转移到生根培养基上生根，并进一步筛选。
1．4 抗性株嵌合体的鉴定与分离
从带有黄化叶的抗性株上切取生长较好的真叶。植入不定芽诱导培养基中培养 20～30 d后，将
不定芽再移至选择培养基及生根培养基中筛选及生根 ，同时观察芽诱导及植株生长情况。
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2期 张军杰等：大白菜的马铃薯蛋白酶抑制剂基因转化及抗菜青虫性的鉴定 195
1．5 抗性株的分子鉴定
目的基因的PCR及 PCR—Southern杂交：抗性株总 DNA的提取采用 SDS法 。以抗性株基因组
DNA为模板，以无菌水和非转化株基因组DNA为对照，分别以bar基因、p I1基因的引物进行PCR
扩增，1％琼脂糖凝胶电泳。PCR产物经电泳检测后，以DIG标记的6口r基因、p Ⅱ基因片段制做探
针，进行杂交鉴定。
植物基因组 DNA的Southern杂交：以上述提取的植物总 DNA为样品，以质粒 pBBBasta-pin I1经
I和Spe I双酶切DNA为正对照，以非转化株基因组DNA为负对照，经 R I 37~C过夜酶切、
0．8％琼脂糖40 V凝胶电泳分离，通过吸印法将DNA转移到Hybons—N 膜上，用 DIG标记的bar基
因探针进行Southern杂交。探针标记、预杂交、杂交、SSC洗脱以及x光片显影等操作按杂交试剂盒
说明书方法进行。 、
探针标记、杂交及检测试剂盒为 DIG Hi gh Prime DNA Labeling and Detection Stater Kit I1，购自
Roche Diagnostics Co．。
1．6 转化株的抗虫性鉴定
待转化株长至7～8叶时，进行饲虫试验。在 9 cm培养皿内垫两层滤纸，无菌水浸湿后置适量
新鲜大白菜转化株叶片 (混株取样)，以非转化株大白菜叶片为对照，每皿接五头当日孵化出的菜青
虫 (Pieris rapae L．)，28~C恒温培养。重复8次，隔天更换新鲜叶片、检查存活虫数 (以毛笔轻轻触
动虫体，无任何反应的判为死亡)，记录幼虫的发育状况，称虫体质量。采用13龄作为其发育期的标
志，记录虫龄，直至化蛹、羽化，记录其总化蛹率。
2 结果与分析
2．1 抗性植株的诱导及筛选
在转化过程中大白菜对农杆菌的侵染十分敏感，经过侵染的子叶一子叶柄在共培养基上培养3 d
后，子叶柄切口处出现不同程度的褐化，共培养之后直接转移到不定芽诱导培养基上，3～5 d后约
有70％的外植体子叶柄切口膨大，但无愈伤组织形成。随着时间的推移，其中的30％～50％外植体
形成愈伤组织，有少量愈伤组织进而诱导出不定芽 (图2，A)。将不定芽转到选择培养基上继续进
行筛选培养，一周后诱导出的不定芽有大部分都黄化而死，说明其为逃逸体，少量不定芽在l5～20 d
后能够长成植株 (图2，B)，但有些植株出现黄化的叶片，分析原因可能是嵌合体。按获得的除草剂
抗性植株占总处理外植体的百分率计，本试验条件下的转化率为1％左右。
2．2 抗性株嵌合体的鉴定与分离
从带有黄化叶片的抗性株上切取的长势较好的真叶，都能诱导出正常生长的不定芽 (图2，C)，
而且没有黄化的叶子产生，这说明在筛选的抗性株中确实存在着嵌合体。为了克服嵌合体的产生，从
嵌合体上切取生长较好的真叶进行真叶再生，再生出来的植株在选择培养基上完全没有黄化的叶片。
这样不但可以从嵌合体中获得完全的转化株，而且可以对转化株进行繁殖，从而降低试验中可能存在
的因为污染等因素而使转化株死亡的概率。
2．3 再生株的除草剂抗性
再生株在较高浓度的Basta选择压下生根后，移栽入温室营养土中。待植株恢复旺盛生长后，在
植株叶片进行高浓度的Basta涂抹试验，以通过对除草剂抗性的鉴定，进一步验证其转基因性质。结
果表明，经0．5％Basta溶液 (750 mg／L PPT)涂抹后，再生株叶片没有出现明显枯斑，表现出除草
剂抗性；而对照叶片枯死 (图2，D)。本试验体系采取在转化细胞的筛选及不定芽诱导过程中，逐
步提高筛选压的办法，以缓解初始转化细胞的生长压力，并在后期降低逃逸株的频率。结果表明，在
移栽人温室的再生株中，仅发现一株可能为逃逸体 (见基因组Southern杂交结果)，而其它植株具有
高水平的除草剂抗性。
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l96 园 艺 学 报 31卷
图2 转基因白菜的获得
A．外植体在不定芽诱导培养基中；B．转化株与对照存选择培养基中；C．扼性株真叶在选择培养基上再生；D．转化株 对照涂Basla后
Fig． 2 Obtaining of p／n iI transgenic Chinese cabbage
A．Explants in shoot inducing medium with P 3．5 nlg／I ：B Transfi)rmed plant and control in selection medium with P 6mg／I
C．Shoot regeneration from young leaf disc of t)asta resistant plant in selection medium；D．Basra(750 mg／L PPr)
daub on the leaves of translbrmed plants and Ihe control in green house．
2．4 抗性株的分子生物学鉴定
PCR及 PCR—Southern杂交结果 (图3)表明：PCR扩增出的条带即为pin 1I基因、bar基因目的条
带，4株抗性株都有外源基因 bar、pin 1I基冈插入，而空白样品和对照植株 (未转化株)没有扩增出
目的带，初步证明了pin I基因和bar基因已经整合到大白菜抗性株基因组中。
M a b C d e f g M a b c d e f g
b C d e f g b C d e f g
图3 抗性株PCR及 PCR-Southern杂交结果
A．胁 lI引物 PCR扩增，B．bar引物 PCR扩增，C．PinlI探针 PCR—Southern杂交，D．bar探针PCR—Southem杂交：
(M：1 kb ladder；a：空白对照；b：质粒正对照； 未转化对照；d～g： Ⅱ转基因植株 1、2、3、4克隆)
Fig． 3 PCR and PCR·Southern blot analysis on Basra resistant plants
A-PCR analysis using却 Ⅱprimer；B．PCR analysis using bar primer；C PCR一~)nthent blot using Ⅱprobe；D．PCR—Southern blot using bar pmbe
．
(M．1 kb ladder；a．blank with water；b．pBBBasta-pin lI plasmid as positive c0ntrol：
C．NON—transformed plant as negative eontnd；d—g
． transformed plants)
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2期 张军杰等：大白菜的马铃磐蛋白酶抑制剂基因转化及抗菜青虫性的鉴定
抗性株的总DNA经 o尺I酶切、电泳分离、转膜，用 bar基因为探针进行Southern杂交 (图
4)，可以看出抗性株 1、2、3、4都有两条杂交带，而非转化对照基因组未出现任何杂交信号，说明
4个抗性株基因组DNA中都有bar基因的插入。根据酶切电泳图谱及杂交后x光片可以看出最上面的
杂交带是在荧光尺1．1 Cll处，是电泳图谱中最大DNA片段处，这可能是酶切不完全造成的，另一杂
交条带除转化株1在8 kh位置处外，其它转化株在2．I kb处。这说明转化株1是一个单克隆；2、3、
4转化株由于来源于一个外植体，Southern杂交带型也一致，故可以认为它们为一个单克隆。转化株
5可能是逃逸体，没有出现任何杂交信号
M a b c d e f g R a b c d e f g
图4 抗性株基因组DNA bar基因Southern杂交图
A．抗性株基因组EcoR I酶切，B．bor基『J,l探针抗性株 Southern杂交图。
(M．I kb ladder；R：荧光尺；a．质粒正对照；b．未转化大f I菜对照；c～g．转化株 l、2、3、4、5克隆基因组 DNA)
Fig． 4 Genomic Southern blot analysis of transgenic plants using bar gene as probe
A．Eleetrophoresis of digested DNA； B．South, rn blot using Dig—labled bar probe．
(M．I kb ladder；a．pBBBasta-pin 1I plasmid DNA digested with Et oR I and sm I：b．non—transformed control plant DNA
digested with EcoR I：【、一g．transfiwme,l plants DNA digested with EcoR I)
2．5 转基因大白菜的饲虫试验
从图5可以看出菜青虫取食转基因株与对照
株供试叶片后，刚开始二者的存活率没有显著差
异，但随着龄期的增大，取食转基因叶片的菜青
虫死亡率逐渐上升，到成虫时高达78．3％。故pit
Ⅱ基因所产生的蛋白对菜青虫的生长起着一定的
累积致死作用。此外，当达到12 d龄时，有两头
幼虫保持在2龄虫态，同时有4头保持在3龄状
态，这些幼虫不能正常脱皮而死亡 (图6)，而对
照存活的幼虫已经全部进入5龄期。最后取食转
基因植株叶子的幼虫化蛹率为25．2％，对照为
一
0
槲
U
转化株 Transgenic ◆
对照 C0ntr0l ◆
0 3 6 9 12 15 18
饲喂天数 Feeding days
图5 转基因大白菜对取食菜青虫生长发育的影响
Fig． 5 Larvae mortality of P． fed with transgenic Chinese
cabbage or control leaves during diferent incubation days
图6 抗虫性鉴定
A．二龄停止生长的昆虫；B．： 龄停止生长的昆虫
Fig． 6 Bioassay for Pieris rapae L． resistance
stopped at the second instar； B Larvae of Pieris rapae L．stopped at the thiM instar
◆
◆
一
一一
舯 砷如 {；∞加 0
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198 园 艺 学 报
74．4％，两者差异达到显著水平。蛹的羽化率和
下一代雌雄比在取食转基因叶片和非转基因对照
间没有显著差异。室内生物测定表明，转化株老
叶对菜青虫幼虫的毒杀作用明显高于嫩叶，取食
转化株老叶的菜青虫幼虫 6 d后全部死亡，而取
食非转化株老叶的菜青虫幼虫6 d后死亡率只有
19．04％，有明显差异 (表 1)。
3 讨论
表1 取食不同发育时期叶片菜青虫的死亡率
Table1 Larvamortality of P． rapaefed with diferent age
leaves of transgenic Chinese cabbage or control f％ )
在大白菜基因转化前期工作中发现，种子萌发后切取带 1～2 mm子叶柄的子叶，子叶柄末端切
口处的细胞不但再生能力强，而且易被农杆菌感染和转化，因此本试验采用子叶一子叶柄为农杆菌转
化的外植体。外植体在受农杆菌感染及共培养后，在不定芽诱导培养基中子叶柄切口末端的转化细胞
和未接触培养基的非转化细胞分裂，使切口端显著膨大，但随着时间的推移，转化细胞仍能够旺盛分
裂，非转化细胞却不能再分裂，所以很多外植体切口端不再继续膨大，甚至变黄死去。但转化细胞能
够解除其周围培养基中的PPT毒性使得其临近的非转化细胞得以成活，所以在初次筛选时得到的抗
性芽会有不少嵌合体或逃逸体，在第二次高浓度的筛选压时逃逸体就会变黄死去，但是抗性株中还有
嵌合体，它们有部分叶子变黄，但大部分叶子颜色正常。用嵌合体生长较好的叶子做真叶再生，再生
植株在选择培养上不再有变黄的叶子，所以在很大程度上降低了嵌合体频率。
转化株的饲虫效果检测表明，转基因植株叶片的抗虫效果主要表现为抑虫效应。菜青虫取食转基
因植株叶片后中毒反应比较缓慢，但毒性具有累加效应。中毒的菜青虫幼虫平均体重比较轻，其生长
发育受到不同程度的抑制，在成虫时的死亡率约为取食非转基因叶片对照虫体的两倍，且其存活成虫
的化蛹率大大低于对照虫体。另外可能由于转化株的老叶积累的外源基因表达产物——蛋白酶抑制剂
较多，对菜青虫幼虫的毒杀作用更强。试验结果表明，获得的转基因大白菜对降低虫害，特别是降低
菜青虫的种群繁衍速度具有一定的作用。获得的pin 1I转基因大白菜的这种对害虫生长、繁育具抑制
作用的抗虫特性，虽然对当代取食害虫没有完全的致死作用及对植株的完全保护作用，但是另一方
面，有人认为，这样可以延缓害虫在种群内产生抗性的时间，使转化株在较长时间内具有抑虫能
力 ⋯¨。我们的试验和其它应用蛋白酶抑制剂进行害虫防治的试验均表明，蛋白酶的抗虫效果都基本
表现为非完全致死，其影响因素可能是蛋白酶抑制剂在植物体内的表达量，以及取食害虫的逐步生理
调节适应能力。要获得对转基因植株的完全保护作用，并且延长其有效期，在同一植株中转入不同作
用机制的抗虫基因可能为一可选择途径，该项工作我们目前正在进行中。
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