全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 4) : 356~ 358
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 02- 09; 修回日期: 2001- 06- 01
基金项目: 北京市重点实验室资助项目 (951890211)
* 现在华南师范大学生物系做博士后研究。
* * 通讯作者。
抗癌基因 p53导入番茄的初步研究
李晓东1, * 曹宛虹1, * * 刘 玲1 陈 杭1 程智慧2
( 1北京市农林科学院蔬菜研究中心蔬菜种质改良实验室, 北京 100089; 2 西北农林科技大学园艺学院,
杨凌 712100)
摘 要: 通过根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumefaciens) 介导, 利用特异表达的 phaseolin 基因
的启动子与人类野生型抗癌基因 p53 构建嵌合基因, 对 美味樱桃 番茄进行遗传转化, 获
得转化番茄再生植株。通过组织化学法、PCR扩增及 Southern 杂交检测, 证明人类野生型 p53
基因已整合到转基因番茄植株的基因组。
关键词: 番茄; 人类野生型抗癌基因 p53; 遗传转化
中图分类号: S 641. 2; Q 785 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 04035603
1 目的、材料与方法
抗肿瘤基因 p53是现在癌基因研究中最引人注目的肿瘤抑制基因!1∀, 引入野生型 p53
基因可能是基因治疗癌症潜在的有效方法!2~ 4∀。目前野生型或突变型 p53基因或蛋白可通
过动物或微生物途径获得, 尚未见其在植物中表达的报道。本研究拟通过土壤农杆菌的感
染, 将人类野生型 p53基因转入番茄, 以研究其在番茄中的整合、表达等生物学表现, 希
望获得表达 p53基因的植株, 以探索借助番茄作为生物反应器生产野生型 p53蛋白的可能
性。
以 美味樱桃 番茄无菌苗子叶作为转化外植体, 根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumef a
ciens ) 菌株为 GV3101, 高效表达载体 pBI121p53ph由目的基因 p53与含高效启动子的表达
载体 pBI121连接 (图 1)。
采用农杆菌介导的叶盘共培养转化法, 方法如下: 切取叶盘放于 MS+ ZT 2. 0 ( mg/ L,
下同) + IAA 0. 05培养基, 25 # 光下预培养 24 h; 预培养的外植体在菌液中浸泡 30 min,
无菌纸吸干菌液, 将外植体转入选择诱芽培养基, 置于28 # 暗处共培养 2 d后, 25 # 光培
养; 选择诱芽培养基为MS+ ZT 2. 0+ IAA 0. 05+ Kanamycin (卡那霉素, Km) 50+ Carbeni
cillin (羧苄青霉素, Cb) 250, 生根培养基为MS+ IAA 0. 1+ Km 50+ Cb 100, 培养基中琼
脂浓度为 8 g/ L, 蔗糖浓度为 30 g/ L。对经过 Km 抗性鉴定的转化植株进行 GUS 染色、
PCR扩增、Southern杂交检测。
2 结果与分析
2. 1 转化苗的生长
对照外植体的诱芽率在 85%以上, 用于转化的外植体的诱芽率较低。在添加Km的选
择培养基上, 大部分外植体黄化逐渐死亡, 只有少数外植体培养2周后出现小芽点, 3~ 4
周后逐渐分化出幼叶, 形成小芽。待芽长出 2~ 3枚叶片时, 切下芽转入生根培养基, 幼
芽逐渐生出新叶长成幼苗, 当幼苗根系发达后移入温室。整个诱导、培养过程中都有 Km
选择压力存在。
图 1 载体质粒 pBI121p53ph的构建图
Fig. 1 Construction of vector plasmid pBI121p53ph
2. 2 组织化学染色法检测
植物表达载体 pBI121p53ph携带有 GUS报告基因, 因此可通过组织化学染色法进行初
步检测。本试验以 Xgluc为底物, 染色结果显示阳性植株的叶片呈蓝色。
2. 3 PCR扩增筛选
取GUS检测初步确定的转化番茄植株再进行 PCR 扩增检测。出现大小为 1. 2 kb 的
p53编码序列的特异条带 (图 2) , 表明在该植株中有目的基因片段存在。
2. 4 Southern杂交分析
用经PCR检测的转化番茄植株叶片提取总DNA, 限制性内切酶 EcoRI酶切后转膜, 进
行Southern杂交, 结果如图 3所示。转化番茄植株有杂交带出现, 说明 p53基因已经成功
整合到番茄的基因组中, 最终获得 5株转基因番茄植株。
图 2 转基因番茄植株的 PCR检测
M. DNA/ Hind III+ EcoRI 双酶切分子量标准;
1~ 3转化番茄植株的不同株系。
Fig. 2 PCR analysis for transgenic tomato plants
M. DNA/Hind III+ EcoR I marker;
1- 3. Different lines of transgenic tomato plants.
图 3 转基因番茄植株 Southern blot 检测结果
1. 转化番茄植株; 2. 非转化番茄植株 (对照) ;
3. DNA/Hind III+ EcoR I 双酶切分子量标准。
Fig. 3 Southern blot analysis of transgenic tomato plants
1. Transgenic tomato plant ; 2. Untransgenic tomato
plant ( Control) ; 3. DNA/HindIII+ EocRI marker.
3574 期 李晓东等: 抗癌基因 p53 导入番茄的初步研究
参考文献:
1 Levine A J, Momand J, Finlay G A. The p53 tumor suppressor gene. Nature, 1991, 351: 453~ 456
2 Baker S J, Marko Witz S, Fearon E. Suppression of human colorectal carcinoma cell growth by wild type p 53. Science, 1990,
249: 912~ 917
3 Palazzo J P, Kafka N J, Grasso L, et al. The role of p 53, p21WAF1/C1PI, and bc12 in radioresistant colorectal carcinoma.
Hum. Pathol. , 1997, 28 ( 10) : 1189~ 1195
4 Velaso J A, Medina D L, Romoro J, et al. Introduction of p53 induces cellcycle arrest in p53deficient human medullarythyroid
carcinoma cel ls. Int . J. Cancer, 1997, 73 ( 3) : 449~ 455
Preliminary Study on Transformation of Tumor Suppressor Gene p53 into Tomato
Li Xiaodong1, Cao Wanhong1, Liu Ling1, Chen Hang1, and Cheng Zhihui2
( 1Vegetable Germplasm Improvement Laboratory , Beij ing Vegetable Research Center , Beijing 100089; 2Academy of
Horticulture , Northwest SciTech University of Agriculture and Forestry , Yangling 712100)
Abstract: The strain GV3101 of Agrobacterium tumerf aciens harboring a plasmid carrying a human wildtype tumor
suppressor gene p53 driven by the promoter of phaseolin was used to transform cv. Meiwei Cherry of tomato. Leaves of
transgenic tomato plants were used for assaying the existence of foreign gene. Results of histochemical assay, PCR
amplification and Southern blotting showed that the human wildtype p53 gene was integrated into the genome of trans
genic tomato plants.
Key words: Tomato; Human wildtype p53 gene; Genetic transformation
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358 园 艺 学 报 28卷