全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(4)：473—475
Aeta Horticulturae Simaa
农杆菌介导 GNA基因转化菜薹
张扬勇 李汉霞一 叶志彪 卢永恩 陆芽春
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070)
摘 要 ：以菜薹带柄子叶为外植体，采用农杆菌介导法将特异启动子 PRS,一l与雪花莲凝集素 (GNA)基
因构建的嵌合基因转化菜薹，获得26株 Km抗性植株，经过PCR检测和PCR-Southem杂交分析证明其为转
基因植株。
关键词 ：菜薹；遗传转化 ；雪花莲凝集素基因 (GNA)
中图分类号：S 634．5 文献标识码 ：A 文章编号：0513．353X (2003)04-0473．03
1 目的、材料与方法
菜薹 (Brasica carapestris sp．chinensis vat．parachinensis)又名菜心，是我国南方很重要的蔬菜作
物之一。蚜虫是危害很严重的刺吸式害虫，其造成的伤口为其他病原体的侵染提供了通道。研究表
明，雪花莲凝集素对刺吸式昆虫有较好的抗虫效果l1．2J。本试验通过农杆菌介导法将韧皮部特异表达
启动子RSs．1(rice sucIDse synthase．1，水稻蔗糖合成酶)与雪花莲凝集素 (Ga／anthus n／va／d A~,lutinin，
GNA)基因构成的嵌合基因转化菜薹，获得转基因植株。
菜薹品种为 ‘45天油青菜心’，市售种子。农杆菌菌株为 LBA4404，其所含质粒为 pRSSGNA1。在
质粒的T—DNA区段上携带有 RSs．1启动子控制的 GNA基因，CaMV35S启动子驱动的 N／r／I基因。该
质粒由复旦大学遗传所唐克轩教授提供。
PCR引物 由上海生物工程公司合成，左引物 (Left Primer)序列为：5-AGACAATCGo C．CIL-T．
GAT．3’，右引物 (彤 Primer)序列为：5’．TCATIqX2GAACCC CAGAGTC．3’。
将种子表面灭菌后，接种于 1／2MS培养基上。切取 4 5 d无菌苗的带柄子叶为外植体 ，将子叶
柄基部插人分化培养基 (MS+2 rng／L BA+0．5 rng／L NAA+5 rng／L AgNO3)中2—3 mln，预培养2 d后
取出放在培养皿中，加人准备好的菌液 (OD值为 0．3 0．6)浸染 10 min，取出放在灭菌滤纸上将菌
液吸干后，接回到原来的分化培养基中。共培养 2 3 d后，再转人到附加 500 mg／L头孢霉素 (Cef)
和5 mg／L卡那霉素 (Km)的筛选培养基中，每 2周继代 1次，同时逐渐降低 Cef浓度。培养 4周即
可得到抗性芽，芽长到2 cm高时，切下不定芽并转入到生根培养基 (MS+0．5 mg／L NAA+5 mg／L Km
+200 mg／L Cef)。
采用 SDS方法，提取转化和对照植株叶片 DNA，进行 PCR检测。扩增产物用 0．8％琼脂糖凝胶电
泳检测。分子杂交所用的探针为 740 bp的 朋 Ⅱ基因片段 ，探针标记采用随机引物法匏P-dCTP 10 20
i放射标记。
2 结果分析与讨论
2．1 转化植株的获得
预培养 2 d后 ，将子叶转到筛选培养基上 ，进行抗性芽的筛选。两周后，含有 5 mg／L Km的培养
收稿 日期 ：2002—08—28；修回日期：2003—03一l1
*现工作单位 ：中国农科院蔬菜花卉研究所。
**通讯作者 ：lhx02@hotmail．coin
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474 园 艺 学 报 30卷
基上的菜薹子叶外植体的子叶柄处白化并且膨大，然后出现白色或紫色芽，没有绿芽出现。因此本研
究延迟选择，先在不加 Km的筛选培养基上 1周左右，然后转到含 Km的筛选培养基上，大多数子叶
基部变黄，最终死亡，有少数子叶的伤口基部能长出绿色愈伤组织，在愈伤组织上分化出绿色不定
芽，经过 4周的 Km筛选，仍为绿色。在 Km筛选过程中，如果共培养后立即施加筛选压，则很难得
到抗性芽。而采用延迟选择进行筛选在油菜 、甘蓝上都已取得成功[3J，在本试验中将其用于菜薹也获
成功，表明延迟选择可行。
得到的抗性芽在生根培养基上 4～5周后就可以形成具有发达根系的完整植株，炼苗后移栽到花
钵中，按实生苗管理，能正常开花、结实。
2．2 菜薹转化植株的分子检测
本试验共获得 26株 Km抗性植株，采用小量法提取菜薹转化植株和对照植株 DNA，进行 PCR检
测。结果见图 1。从图 1可以看出，阳性对照质粒 DNA在 740 bp处有一条特异扩增的电泳带，而阴性
对照没有扩增带，在 26株 Km抗性植株中，PCR检测为阳性的有 24株。由此表明外源基因已经整合
到菜薹基因组中。
PCR检测为阳性的植株 ，将 PCR产物电泳后转膜，进行分子杂交，结果如图 2。可以看出，质粒
DNA和转化植株 DNA均有杂交信号，而未转化植株的DNA无杂交信号。
已获得的转基因植株的目的基因能否表达，表达效率的高低如何，是不是韧皮部组织特异表达
等，都有待于进一步研究。
l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 l1 l2 l3 l4 l5 l6
图 1 转化植株的 PCR检测
l～3，5～l3 转化植株；4．未转化植株；14．阴性对照；15．质粒 DNA；16．PCR n1arker
rig．1 PCR analysisin transgenic plants
l一3．5一l3．Transgenic plants；4．Untransfonn~ plants： 14．Negative control； 15．Plasmid DNA； 16．PCR marker
l 2 3 4 5 6 7 8 9
图2 转基因植株 PCR产物的 Southern blotting检测
1．质粒 DNA；2 阴性对照；3—9．转化植株
Fig．2 Southern blot analysis ofPCR productsfrom transgenlc plants
1．Plasmid DNA；2．Negative Control；3—9．Transgenic plants
参考文献：
1 Rao K V，Rathore K S，Hodges T K，et a1．Expresion of snowdroplectin(GNA)intransgenic rice plants confers resistanceto rice brown plan—
thopper．Plant J．．1998，4 (15)：469～477
2 Hilder V A，Powell K S， Gatehouse， et a1．Expresion of snowdrop lectin in transgenic tobacco plants results in added protection against aphids．
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4期 张扬勇等：农杆菌介导 GNA基因转化菜薹 475
Transgemc Res．． 1995．4： 18～25
3 王关林，方宏筠．植物基因工程原理与技术 ．北京：科学出版社，1998．194～236
Genetic Transformation of Flowering Stalk、vith Snowdrop Lectin Gene(GNA)
Zhang Yangyong， Li Hanxia，Ye Zhibiao， Lu Yong’en，and Lu Yachun
(National Key Laboratory ofCrop Genetw Improvement，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)
Abstracts： Cotyledons with petiole of Flowering stalk were tran sform ed with the vector carrying a snowdrop
lectin gene(Galanthus nivalid Agglutinin，GNA)．Twenty—six transformants were obtained from cotyledons of
Flowering Stalk． They were eonfimled to be transformants by the PCR and PCR—Southern blot analysis．
Key words：Flowering stalk；Genetic transformation；Snowdrop lectin gene(GNA)
姜花挥发性成分的固相微萃取一气相色谱质谱分析
范燕萍 余让才 黄 蕴 陈玉芬 (华南农业大学-园艺学院；z生命科学学院，广州510642)
Studies on the Essential Constituent of Hedychium flavum and H．coronarium
Fan Yanping ，Yu Rangeai ，Huang Yun ，and Chen Yufen ( Colege ofHorticulture， College of Science，South
China Agricultural University，Guangzhou 510642，Ch／na)
关键词：姜花 ；挥发性成分；固相微萃取；气相色谱 一质谱联用法
中图分类号：S 68 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2003)0l4—0l475—01
分别采取 1 g新鲜黄姜花 (Hedychiurn／z 姗 Roxb．)和白姜花 (H．corol~ Koen．)花瓣和花柱，置4 mL螺口玻璃
瓶中，用聚四氟乙烯衬里的硅橡胶垫密封，插入 100 tan聚二甲基硅氧烷 (PMDS)萃取纤维头，于室温下顶空取样 6o
min。采用 FINNIGAN TRACE MS气质联用仪 (美国)进行分析。色谱条件为 DB-5石英毛细管柱长 30 m，内径 0．25 mm，
液膜厚 0．25肿 ，载气 He，柱头压力 68．974 kPa，程序分流／不分流 (LSS)进样 口温度 250oC。程序升温 ：50oC，保持 2
min；以 3~C／min的升温速度升至 250％，保持 30 min。在 SPME分析中，PSS进样 口设定为不分流进样方式，不分流时间
为 2 rain，衬管采月j 1．51Tlnl内径的玻璃管，脱附时间为3 min；在 DHS进样 V1分流比为20：1，进样量为 2．0止。G&MS 传
输线温度为 250％，质量扫描范围是 30—350 anlu，扫描时间 0．3 S，扫描间隔 0．2 S，EI离子源温度 170％，EI电子能量 70
ev，光电倍增管 (PMT)电压 230 V，对采集到的质谱图用 WII~Y、MAINLIB、REPLIB及 NISIDEMO 4个库进行分析，按
各峰的质谱裂片图与有关文献进行核对，确定姜花挥发性物质的化学成分 ，通过峰面积进行归一化定量。
试验结果表明，黄姜花花瓣挥发性成分共检测有 l0种，鉴出成分占总峰面积的 99．87％。其 中主成分是 1，8一桉
油醇 (35．71％)和 沉香醇 (35．37％)，两 者之和 占全部挥 发性 成分 的 71．08％；金合 欢烯 占全部挥发 性成分 的
17．70％；香叶烯占 3．39％；蒎烯 2．94％；橙花叔烯 2．85％。
黄姜花花柱共检测出 l3种成分，鉴出成分占总峰面积的 99．5l％。1，8一桉油醇 占37．19％，沉香醇 26．45％，金合
欢烯 l3．71％，异法呢醇 5．31％，吲哚 4．52％，子丁香烯 4．46％，橙花叔醇 3．75％。
白姜花花瓣共检测 出 16种成分，鉴出成分占总峰面积 的 99．22％。其中顺式 一罗勒烯酮 占 47．42％，沉香醇 占
21．52％，3一(4，8一二甲基 一3，7一壬二烯基)呋喃 7．55％，桧烯 5．69％，金合欢烯 3．9o％，十八烷基吗啉 2．56％。
白姜花花柱共检测出 21种成分 ，鉴出成分占总峰面积的 99．94％。顺式 一罗勒烯酮 占30．【)5％，沉香醇 19．36％，
桧烯 l6．o3％，1，8一桉油醇 9．72％，异法呢醇 4．77％，顺式 一甲基异丁子香酚 3．96％，a一金合欢烯 3．16％。
另外，还从黄姜花和白姜花的花瓣与花柱中检测出吲哚、反式 一a一金合欢烯、a一绿叶烯、a一子丁香烯、反式子丁香
烯、四氢沉香醇、8一羟基沉香醇、a一萜品醇、二氢 一a一紫罗酮、6一十一烷胺、4,8一二甲基 一1，3，7一壬三烯、十六烷酸、
反式一a一金合欢烯、2一乙基一1，1一二 甲基 一3一亚甲基环已烯、苯乙腈、4一吗啉基 一5一甲基一2一呋喃酮等挥发性成分。
收稿 日期 ：2002—11—08；修回日期：2003—05—06
基金项目：广东省科技攻关项 目 (2002C20010302)
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