全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(6)：673～677
Aeta Horticulturae Sireca
Multi#ex—CAPS技术及其在番茄遗传鉴定中的应用
王孝宣 杜永臣 朱德蔚 Luigi Monti2 S．Grandilo2
( 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081； CNR-IMOF，Research Institute for Vegetable and Ornamental Plant Breed—
ing，Portici 80055，Italy)
摘 要 ：应用 Multiplex—PCR和 CAPS(Cleaved amplifed polymorphic sequence)原理研究建立了 Mutiplex—
CAPS技术。该技术包括 ：(1)在 PCR扩增反应体系加入 2对 、3对或多对核苷酸引物 ，经 30～40个扩增循
环后得到每对引物的特异扩增片段 ；(2)应用同一种限制性 内切酶消化这些不 同引物经扩增后获得的特异
片段 ；(3)琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色检测酶切 片段长度的多态性 。利用该技术对 番茄 (Lycopersicon es—
cdentum)TA517及其近等基因系的分析表明 ，Multiplex—CAPS能 同时检测 2个 、3个或多个 CAPS标记 的多
态性 ，其效果等同于每个 CAPS标记的多态性的叠加 ，重复性好 ，分析效率高 ，降低成本数倍 。
关键词 ：番茄 ；分子标记；Muhiplex—CAPS；CAPS；Multiplex—PCR；
中图分类号：S 641．2 文献标识码 ：A 文章编号：0513—353X (2003)06-0673—05
RFLP、AFLP图谱可为更精密的分子图谱构建、新的基因定位 以及分子标记辅助育种奠定基础。
但 RFLP技术需要大量的资金投入和放射性标记步骤 ，Southem吸印 、DNA探针制备、Southem杂交都
是复杂的操作 ，而且需要较长的时间，同时要求大量高质量 的 DNA。AFLP技术虽然只需要少量 的
DNA，但也需要放射性标记步骤 、较长的时间和较大的资金投入 lj，因此在构建分子图谱 、分子育种
及 QTL分析时 ，为了降低成本和提高效率，一些 RFLP标记、AFLP标记和 COS(Conserved Ortholog
Set)标记被转换为 CAPS标记，其主要步骤是对上述标记使用的克隆进行测序 ，根据序列的信息设计
一 对引物，用该引物对基因组进行特异扩增 ，再用特异的限制性内切酶消化 ，电泳检测酶切产物的多
态性，如果多态性与上述标记相符合，即获得了 CAPS标记。即便如此 ，CAPS的分析成本仍然很高。
作者在将 RFLP和 COS标记转为 CAPS标记的过程中发现一些 CAPS标记分享同一种限制性内切酶。根
据 Multiplex—PCR在同一扩增反应中应用不同引物对能同时扩增相应序列的优点 ，以及多个 CAPS标
记分享同一限制性 内切酶的事实 ，本研究结合 Muhiplex—PCR和 CAPS的优点 ，建立了 Mutiplex—CAPS
技术 ，并用该技术对番茄 TA517及其近等基因系进行了分析。
1 材料与方法
1．1 材料
番茄 TA517、E6203，二者杂交后代的 12个近等基因系。TA517由普通番茄 (Lycopersicon esculen．
turn CV．E6203)与多毛番茄(L．Hirsuturn)LA1777杂交后分离而得 ，含有来 自于多毛番茄第 4染色体
底部 的 50 cM DNA片段【0，引，02168、02169、02P70、02P71、02P72、02P73、02P74、02P75、02P76、
02P77、02P78、02P79由TA517与 E6203杂交后再经过多代 自交而得 ，每个近等基因系含有 TA517上
来源于多毛番茄 LA1777第 4染色体上的一小片段。
对照品种 TA517和 E6203各种植 30株 ，每个近等基因系材料种植 10株 ，采取完全随机区组排
列 ，当植株长至 8叶期时，提取幼嫩叶片中的 DNA进行分析 ，DNA提取方法同参考文献 [4]。
1．2 Multiplex—CAPS检测
收稿日期 ：2003—02—24；修回日期 ：2003—07—25
基金项 目：中国一意大利农业科学院科技合作项 目
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674 园 艺 学 报 30卷
1．2．1 Multiplex—CAPS试验步骤的优化 在一系列 CAPS试验中，发现一些 CAPS标记分享 同一种限
制性内切酶 ，如标记 T1203，T1546，TG22，T708等分享限制性 内切酶 Hinf工，TG163和 q974分享限
制性内切酶 Rsa I，考虑到 Multiplex—PCR在同一扩增反应中应用不同引物对能同时扩增相应序列的优
点 ，本试验试 图综合 Multiplex—PCR和 CAPS技术 的优点。首先对单 对引物 (CAPS)和多对 引物
(Multiplex—CAPS)PCR扩增体系中的Md 、Taq DNA聚合酶和模板DNA浓度、退火温度以及限制性
内切酶进行优化，在这些试验基础上，优化的扩增反应体系包括 ：
对照单对引物 PCR扩增体系为50 ng模板 DNA、2．5 10×PCR bufer(Perkin elmer)、250~unol／L
dmTPs、1．25 U Taq DNA聚合酶、3．5 mmol／L Md (最终浓度)，每个引物的浓度为0．2~unol／L，最终
体积为 25 ；对于多对引物 Multiplex—CAPS其 PCR扩增体系与 Multiplex—CAPS基本相同，仅仅是
Md 浓度降低到2．5 mmol／L。
优化的 PCR循 环为：先 92~C 3 min，然 后 40个扩增循 环 92~C 1 min，62cC 1 min 30 S，72~C
2 min，最后一个加尾步骤 72cC 5 min。
琼脂糖凝胶电泳 PCR产物 ，2％琼脂糖凝胶 (TAE缓冲液)，每样品加 5 vL PCR产物 ，3 上样
缓冲液 ，溴化乙锭染色。如果 PCR扩产物与预期结果一致，就对 PCR产物用限制性内切酶消化。限
制性 内切酶反应体系为 1．5 限制性内切酶缓冲液，0．2 限制性 内切酶 ，3．3 ddH20，10
PCR产物。
限制性酶消化反应为 37 4 h。3％琼脂糖凝胶电泳酶切产物 ，每样 品加 15 酶切产物，3 vL
上样缓冲液 ，溴化乙锭染色。
1．2．2 番茄 TA517的 12个近等基因系Multiplex—CAPS分析 加入 2对和 3对引物的 PCR与限制性内
切酶的组合为：TG163+q974一Rsa I；用 TG163一Rsa I和 q974一Rsa I作对照，TG22+T1546+T1203一
Hinf I，用 T1203一Hinf I；T1546一Hinf I；TG22一Hinf I作对照。
对 TA517的 12个近等基因系进行 Multiplex—CAPS分析的引物和限制性内切酶组合为：TG163+
T974一Rsa I，TG22+T1546一Hinf I，TG22+T1203一Hinf I。
本试验所用的 RFLP和 COS标记的序列来 自于美国 Comel大学 ，应用 Primer3程序设计引物，引
物由 Genelab公司合成。引物序列为 ：
TG163：上游引物 5’．TCCAGTCC1TI℃ATCTCCCT 3’，下游引物 5’．TI℃Ca rI A A A ArI AAC1 3’；
TG22：上游引物 5’．1TrAAGCAATGCAGCACAACC．．3，下游引物 5’．GqGC-3EGAGGCCAGAAGTAG-3’；
T1546：上游引物 5’．TC&AAG&AAGACGGAGGAGG-3’，下游引物 5’． AGGCACGCqETCGTrCT．3’；
q974：上游引物 5’．CGCCTITCACAGAAAACCAT．3’，下游引物 5’．AC1W CAAAA1、CAAGGG1、CG3’；
T1203：上游引物 5’．TGCAA~ T1GACTITGTCAT．3’，下游引物 5’．CL-"IqV_,C_,GATCAGTGCATCIT．3’。
2 结果与讨论
2．1 Multiplex—CAPS技术的建立
图 1为加入引物 2974、TG163的 PCR结果 和同时加入这 两个 引物 的 Multi．PCR结果，q974和
TG163经 PCR扩增后分别得到一条分子量为 390 bp和分子量为 1 800 bp的谱带 ，同时加入引物 T974
和 TG163经扩增后得到两条谱带 ，这两条谱带表现为 T974和 TG163两引物的特征谱带的叠加 ，分子
量分别为 390 bp和 1 800 bp。
引物 3974和 TG163的 PCR产物经过限制性内切酶 Rsa I消化后 ，在番茄 E6203和 TA517之间表现
出多态性。引物 q974的PCR产物经消化后在番茄 TA517中得到 2条谱带 ，其特征谱带的分子量为 200
bp，番茄 E6203经消化后得到 2条谱带 ，其特征谱带的分子量为 290 bp。引物 TG163的 PCR产物经消
化后在 E6203和 TA517之间出现多态性 ，TA517消化后得到 2条谱带，特征谱带的分子量为 1 600 bp，
E6203消化后得到 3条谱带，特征谱带的分子量为 900 bp和700 bp。同时加入 TG163和 q974两引物对
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6期 王孝宣等：Multiplex—CAPS技术及其在番茄遗传鉴定中的应用 675
的 PCR产物，经 Rsa I消化后其多态性在 TAS17和 E6203之间表现为这两个引物多态性的完全叠加。
图 2为加入引物 TG22、T1546、T1203的 PCR扩增反应结果和同时加入这 3个引物的 Multi—PCR
反应结果以及利用限制性内切酶 Hinf I消化后的结果。表明，加入 3个引物的 PCR产物为 3个单独引
物 PCR产物的叠加 ，Multi—PCR产物经 Hinf I消化后的多态性也表现为 3个单独引物多态性的叠加。
上述结果表明 ，当不同的 CAPS标记分享同一种限制性内切酶时 ，可利用 MultipleX．PCR方法扩增
出各个引物的相应序列 ，经同一种限制性内切酶消化后检测其多态性 ，其效果等同于每个 CAPS标记
的多态性的叠加 ，本研究将这种技术定名为 MultipleX—CAPS技术。
Z4_ !垒! T9：!±!g163
M 1 2 1 2 1 2
——-一 1800bp
—-一 390bp
Z4． !g! T911±! l63
M l 2 l 2 l 2
PCR Rsa I消化结果 Digestion with Rsa I
图 l 引物 T974、TG163及 T974+TG163的 PCR扩增和限制性内切酶 lisaI消化结果
1．番茄 TAS17；2．番茄 E6203；M．Marker。
． 1 nle PCR amplified profile and digestion witIIlisaI using primerlmirT974- TG163 and both ofthem
1．TomatoTA517；2．Tomato E6203； M．Mal-ktL~／-．
TG22+
TG 1546+
TG22 T1546 T1203 T1203
M l 2 l 2 l 2 l 2
·—一 1500bp
-’一 950bp
·—一 550bp
TG22+
TGl546+
TG22 T1546 T1203 T1203
M l 2 l 2 l 2 l 2
290bp
200bp
· 一 660bp
220bp
ji828
PCR Hinf I消化结果 Digestion with Hinf I
图 2 引物 TG22、T1546、Tl203及 TG22+T1546+Tl203的 PCR扩增和限制性内切酶 HinfI消化结果
1．番茄 TA517；2．番茄 E6203；M．Marker。
． 2 nle PCR amplifed profile and a~esaonwithHinfI using primer pairTG22，T1546，Tl203 and both ofthem
1． Tomato TA517； 2． Toma to E6203； M ． Marker．
2．2 Multiplex—CAPS技术对番茄 TA517及其近等基因系的遗传鉴定
图 3为利用引物 3974和 TG163对 TA517的 l2个近等基因系的 Multiple)【一CAPS分析结果 ，表明同
时加入两个引物的 PCR酶切产物的多态性表现好 ，与预期结果一致l、3j。
为验证 Multiplex—CAPS的可靠性 ，用引物对 TG22、Tl546和 T1203并用限制性内切酶 Hinf I对
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TA517的 12个近等基因系进行了同样的试验 ，结果如图 4、图 5。同时加入 T1203和 TG22以及同时加
入 T1203和 T1546引物对 TA517的 12个近等基因系的 Multiple—CAPS分析表明，两个引物酶切后的多
态性表现为单个引物多态性的叠加，并与预期结果一致 引。
M l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 l1 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1O l1 12
PCR Rsa I消化结果 Digestion with Rsa I
图 3 利用 I974和 TG163对 TAS17的 l2个近等基因系的 Multi—CAPS分析结果
M．1 kb plus；1—12 分别为番茄 T&517的 12个近等基因系。
Fig．3 TheMulti—CAPS result of12 sub-NlLs ofTAS17 using primer pair q974 and TG163
M． 1 kb plus．1— 12．Represent 02P68，02P69 02P70，02P71，02P73，02P74，02P75，02P76，02P77，02P78，02P79，02P72
M CKlCK2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ll l2 M CKlCK2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PCR ltinf I消化结果 Digestion with ltinf l
图 4 利用 TG22和 T1546对 TAS17的 l2个近等基因系的 Multi—CAPS分析结果
M．1 kb plus；CK1．番茄 TAS17；CK2．番茄 E6203；1～12．分别为番茄 TAS17的 12个近等基因系。
Fig．4 TheM ulti—CAPS result of12 sub-NlLs ofTAS17 using primer pairTG22 andT1546
M． 1 kb plus；CK1． 1"A517； CK2． E6203； 1— 12．Represent 02P68，02P69，02P70—02P79 respectively
M CKlCK2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M CKICK21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
P R ltlnf l消化结果 Digestion with ltinf l
图5 利用 T1546和 T1203对 TAS17的 l2个近等基因系的 Multi—CAPS分析结果
M．1 kb plus；CK1．番茄 TAS17；CK2 番茄 E6203；1—12．分别为番茄 TAS17的 12个近等基因系
Fig．5 TheMulti—CAPS result of12 sub-NlLs ofTAS17 using primermirT1546andT1203
M． 1 kb plus． CK1．TAS17；CK2． E6203； 1— 12 Represent 02P68，02P69，02P70—02P79 respectively．
··-一 150bp
p } p p
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6期 ￡孝宣等 ：Multiplex—CAPS技术及其在番茄遗传鉴定中的应用 677
综上，Multiplex—CAPS方法综合了 Multiplex—PCR与 CAPS的优点，与单个引物对 CAPS标记相
比，提高了分析效率 ，数倍地降低了成本 ，因此可用于番茄的分子图谱构建及分子标记辅助育种。考
虑到作物双链 DNA和限制性核酸内切酶的一般性 ，理论上该技术也可以广泛应用于其它作物。Multi—
plex—CAPS的缺点在于：(1)和 CAPS一样需要知道 DNA的序列信息 ，再根据序列设计相应的引物，
同时 Multiplex—CAPS需要获得每个 CAPS的限制性 内切酶信 皂、；(2)Multiplex—CAPS的 PCR反应体系
需要进行优化，且分子量相近的谱带在普通的电泳过程中难以分开。QIAGEN公司最近推出了新的
PCR Bufer，该 Buffer含有 NH4+和 K ，由于 NH4+和 K 对扩增反应体系的平衡作用，用此 Buffer能同
时扩增出 2～8个不同的引物对 J，如果利用类似 Buffer，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳提高酶切产物的分
辨率，可以克服 Multiplex—CAPS的缺点。
参考文献 ：
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The Establishment of M ultiplex ——CAPS Technique and Its Application for
Genetic Characterization in Tomato
Wang Xiaoxuan ，Du Yongchen ，Zhu Dewei ， Luigi Monti2
，
and S．Grandillo2
(‘Institute ofVegetables and Flowers，Chinese Academ)ofAgricultural Science，Beijing 100081，China； CNR-IMOF，Research In—
stiulefor Vegetable and Ornamental Plant Breeding，Portici 80055，haly)
Abstract：An eficient an d reliable technique Multiplex—CAPS was developed for genetic characterization by
combination of two principles Multi—PCR and CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequence)in tomato．This
technique included (1)using 2 or 3 or more than 3 primer pairs in the same am plification reaction，after 30—40
thermal cycles the PCR yield diferent products which correspond to each individual primer pair， (2)using only
one enz、11e to digest these diferent PCR products， (3)Using agrose gel electrophoresis to detect polymorphisms
followed by ethidium staining．By comparison with CAPS， Multiplex—CAPS Can detect the polymorphism of 2 or 3
or more than 3 primer pairs in the same am plifcation reaction at the same time．Th e polymorphism of Multiplex—
CAPS equal exactly the polymorphism supe rimpose of each individual primer pair．Multiplex—CAPS has good re—
producibility with high an alytical efect， lOW cost， lOW labor and time consuming．
Key words：Toma to； Multiplex—CAPS； CAPS ； Multiplex—PCR
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