全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (5) : 902～904
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 11 - 25; 修回日期 : 2005 - 05 - 253 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: Lulu636@ tom1com)
SSR标记技术在甜瓜杂交种纯度检验中的应用
艾呈祥 1 　陆　璐 1, 23 　马国斌 3 　刘志昕 1
(1 中国热带农业科学院生物技术研究所 , 热带作物生物技术国家重点实验室 , 海口 571101; 2 甘肃农业大学农学院 ,
兰州 730070; 3 上海市农业科学院园艺研究所 , 上海 201106)
摘 　要 : 以两个甜瓜杂交品种 (系 ) ‘东方蜜 1号 ’和 ‘01231’及其亲本为材料 , 用 SSR分子标记技
术研究杂种与其双亲之间扩增谱带的多态性 , 以甄别真假杂种。所试验的 23对 SSR引物中有 8对引物分别
在两个甜瓜杂交种和其双亲之间存在扩增多态性 , 表现为 : 多数 SSR引物对自交系的扩增只出现 1条带 ,
但部分引物在某些自交系中扩增出 2条带 , 杂交种条带均为父母本的互补型 , 很适合做杂交种纯度鉴定。
用引物 M6 对 ‘东方蜜 1号 ’和引物 M17对 ‘01231’各 100粒单种子进行 SSR鉴定 , 所测纯度分别为 100%
和 96% , 与田间纯度 9916%和 9612%非常接近 , 显示出 SSR标记技术在甜瓜杂交种子纯度的室内快速检
测中有广泛应用前景。
关键词 : 甜瓜 ; SSR标记 ; 扩增多态性 ; 纯度检验
中图分类号 : S 652　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0520902203
Applica tion of SSR M arkers in Hybr id Seed Pur ity Test of M elon
A i Chengxiang1 , Lu Lu1, 23 , Ma Guobin3 , and L iu Zhixin1
( 1 Institu te of B ioscience and B iotechnology, S tate Key L ab for Tropical C rops B iotechnology, Chinese A cadem y of Tropical A gricul2
ture Science, Haikou 571101, China; 2 College of A gronom y, Gansu A gricultural U niversity, L anzhou 730070, China;
3 Horticultural Research Institu te, Shanghai A cadem y of A gricultural Sciences, Shangha i 201106, Ch ina)
Abstract: The polymorphism of 2 melon hybrids ( ‘Dongfangm i 1’and ‘01231’) and its parental
lines were analyzed with SSR marker system. Eight out of 23 pairs of SSR p rimers were selected, which gave
stable and polymorphic amp lification p rofiles in hybrids and their parents. The bands of hybrid melon were
comp lement types of their parents, which were adap ted to exam ine purity of hybrid melon seed. PrimerM6 was
selected for SSR identification with 100 single seeds of‘Dongfangm i 1’, and p rimer M17 for‘01231’. The
purity was 100% and 96% , respectively, which were app roximate to their field purity (9916% and 9612% ,
respectively). It suggested that SSR technique has wide p rospective in hybrid seed purity test of melon.
Key words: Melon; SSR marker; Polymorphic amp lification; Purity test
1　目的、材料与方法
甜瓜 (Cucum is m elo L. ) 生产中已广泛使用杂交品种。目前鉴定甜瓜杂交种子纯度主要依靠田间
种植检测法 ( Grow2out Test)〔1〕, 需占用土地 , 费时费工。本试验探讨了用 SSR标记技术检测甜瓜杂
交种子纯度的可行性及准确性 , 为实现甜瓜杂交种子纯度的室内快速鉴定打下基础。
以 ‘东方蜜 1号 ’和 ‘01231’两个甜瓜新品种 (系 ) 及其亲本为材料 , 选用了来自 Cucum is属
的 23对 SSR引物〔2, 3〕。引物由北京赛百盛基因公司合成 , Taq DNA聚合酶 Kit和 4 ×dNTPs购自华美
生物工程公司 , DNA标准分子量和 TEMED (N, N , Npi, Npi2Tetramethylethylenediam ine, 四甲基乙二
胺 ) 购自 Promega公司 , 其他试剂为广州化学试剂厂生产。
采用 CTAB法提取两个杂交种及其亲本叶片的 DNA。SSR扩增反应在 AB I公司 Gene Amp PCR
　5期 艾呈祥等 : SSR标记技术在甜瓜杂交种纯度检验中的应用 　
System 2700上进行。反应体系 (25μL) 中含有 10 ×PCR buffer 215μL, 215 mmol/L dNTPs 210μL,
MgCl2 (215 mmol/L) 215μL, 3 U TaqE, SSR 上、下游引物 ( 5 pmol/ μL ) 各 1μL, 60 ng模板
DNA。反应程序为 : 94℃预变性 3 m in, 然后 94℃变性 30 s, 51～54℃退火 30 s, 72℃延伸 1 m in, 共
34个循环 , 最后 72℃延伸 5 m in。扩增产物在测序胶 (610% ) 上进行电泳分离。配制 50 mL 610%聚
丙烯酰胺凝胶 , 加入 715 mL 40% poly acrylam ide ( acrylam ide∶bisacrylam ide = 19∶1) , 215 mL 10 ×TBE
缓冲液 , 21102 g尿素 , 15 mL ddH2 O, 45μL TEMED , 180μL 10%过硫酸铵 (Ammonium Persulfate,
APS)。TEMED和 APS最后加入 , 加入后立即灌胶 , 约 40 m in后胶凝固。安装胶板至电泳槽上 , 倒
入大约 1 800 mL 1 ×TBE缓冲液。在 50 W功率下预电泳 30 m in。PCR产物经变性后取 5μL上样。在
40 W功率下电泳大约 90 m in。
电泳后的凝胶依次在 10%冰醋酸中浸泡 30 m in, 水洗 2～3次 (每次 7 m in) , 011% AgNO3 和
110% HCHO混合液中浸泡 30 m in, 快速用水冲洗 1次 , 然后在 218% Na2 CO3 (每 1 500 mL染色液中
加入 200μL 1% Na2 S2 O3 和 115 mL 37% HCHO ) 中显影至带型出现为止 , 用 10%冰醋酸终止显影。
在白炽灯下观察电泳结果 , 进行数据统计和拍摄照片。
2　结果与分析
211　甜瓜杂交种子及其亲本 SSR多态性分析
通过对来自 Cucum is属的 23对 SSR引物的筛选 , 经过多次重复和比较 , 最终确定带型清晰、稳
定性好的引物作为检测甜瓜杂交种纯度的特异引物。找到在 ‘东方蜜 1号 ’及其双亲间表现多态性
的引物 5对 (M3、M4、M6、M10和 M16 ) , 找到在 ‘01231’及其双亲间表现多态性的引物 3对 (M13、
M17和 M18 )。这些引物具有以下特点 : 母本自交产生的假杂种具有与母本相同的带型 ; 杂株 (假杂种
等 ) 具有 1～4条带 , 其中至少有 1条带与杂交种的谱带位置不同 , 从而能够与杂交种区分 ; 重复性
高 , 用不同批次试剂和进行不同批次 PCR扩增均得出相同的扩增产物电泳谱带。
多数 SSR引物对自交系扩增只出现 1条带 , 但部分引物在某些自交系中扩增出 2条带 , 如引物
M13和 M23对 ‘01231’母本自交系扩增出现 2条带 , 这可能与基因组内存在两个与引物结合的靶位点
等有关。我们对有扩增多态性的引物进行筛选 , 入选标准是对双亲扩增均出现 1条带 , 对杂种扩增有
两条带 , 而且为父母本互补带型 , 条带清晰明亮。用这些入选的引物进行两个甜瓜杂交种各 100粒种
子的纯度检测。
SSR为共显性标记 , 所有杂交组合均是父母本条带的完全互补型 , 可以很好地区分杂交组合和父
母本 , 而且多态性高 , 是纯度鉴定理想的分子标记。
212　对 ‘东方蜜 1号 ’和 ‘01231’种子纯度的检验
图 1和图 2是用引物 M6 和引物 M17分别对 ‘东方蜜 1号 ’和 ‘01231’各 100粒种子的 SSR电泳
图 1　引物 M 6 对甜瓜杂交种 ‘东方蜜 1号’及其亲本自交系的 SSR检测结果
M: 分子量标准 ; 1～11: 母本 ; 12～20: 父本 ; 21～30: F1。
F ig. 1　SSR prof ile of‘D ongfangm i 1’hybr id and its paren ta l lines am plif ied by M 6
M: DNA molecular standard markers; 1 - 11: Female line; 12 - 20: Male line; 21 - 30: Hybrid.
检测结果 , ‘东方蜜 1号 ’的杂交纯度是 100% , ‘01231’为 96% , 而田间鉴定 ‘东方蜜 1号 ’和
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
图 2　引物 M 17对甜瓜新品系 ‘01231’100粒单种子的 SSR检测结果
M: DNA标准分子量 ; 1～4, 6～14, 16, 18～25, 27: F1 ; 5, 15, 17, 26: 假杂种。
F ig. 2　Am plif ica tion results of pr im er M 17 w ith 100 single seeds of‘01231’
M: DNA standard markers; 1 - 4, 6 - 14, 16, 18 - 25, 27: Hybrid; 5, 15, 17, 26: Fake hybrid seed.
‘01231’纯度分别为 9916%和 9612%。因此室内检验结果与田间鉴定结果非常接近。我们又用引物
M16和引物 M18分别对 ‘东方蜜 1号 ’和 ‘01231’再次进行室内纯度检验 , 得到了同样的结果 , 说明
用 SSR方法检测甜瓜杂交种子纯度是完全可行的。
SSR标记对杂交甜瓜及其亲本材料具有很好的区分效果 , 尽管有些供试材料有相似的遗传背景 ,
但 SSR标记仍然可检测到高水平的多态性 , SSR标记在检测等位基因方面显示出可重复性、精确性
和有效性的特点。并且 , 随着品种鉴定和保护意识的增强 , 筛选甜瓜 SSR核心引物 , 建立甜瓜重要
种质的 SSR指纹 , 可以进一步解决杂交种子的真实性问题。
参考文献 :
1　梅　眉 , 陆　璐. DNA分子标记技术在农作物种子质量检验中的应用. 分子植物育种 , 2005, 3 (1) : 129～134
Mei M, Lu L. App lication of DNA molecular markers technique on quality of crop seed. Molecular Plant B reeding, 2005, 3 (1) : 129～134
( in Chinese)
2　Katzir N, Danin2Poleg G, Tzuri Z, Karchi Z, Lavi U, Cregan P B. Length polymorphism and homologies of m icrosatellites in several Cucurta2
ceae species. Theoretical and App lied Genetics, 1996, 93: 1282～1290
3　Danin2Poleg Y, Reis N, Tzuri G, Katzir N. Development and characterization of m icrosatellite markers in Cucum is. Theoretical and App lied
Genetics, 2001, 102: 61～72
中国园艺学会第七届青年学术讨论会
中国园艺学会第九届第 8次常务理事扩大会决定 , “中国园艺学会第七届青年学术讨论会 ”由山东农业大学园艺
科学与工程学院和山东省园艺学会承办 , 将于 2006年 7月或 8月在山东泰安举行。
会议交流主题 : (1) 园艺作物种质资源、遗传育种与生物技术 ; (2) 园艺作物有机、无公害及标准化安全生产 ;
(3) 园艺作物栽培及生理、生态 ; (4) 园艺作物采后处理、贮藏与加工技术 ; (5) 园艺作物病虫害综合治理 ; (6)
园艺环境与工程 ; (7) 设施园艺 ; (8) 园艺作物种业 ; (9) 园艺教育 ; (10) 园艺产品的国内与国际贸易 ; (11) 其
他。会议征文需提交未公开发表过的论文。其撰写格式请参照 《园艺学报 》论文的格式要求 , 字数 (含图表 ) 勿超
过 5 000字。论文可通过电子邮件 ( xkzhao@ sdau1edu1cn; yykx2238@1631com ) 提交 , 也可邮寄拷贝有该论文的 315
寸软盘 (M icrosoftWord格式 )。经专家评审被接受的论文将在会议召开之前编辑成论文集 , 正式出版发行。征文截止
日期 : 2005年 12月 31日。
联系人 : 赵祥奎、王秀峰 ; 联系地址 : (271018) 山东泰安岱宗大街 61号 , 山东农业大学园艺科学与工程学院
“学术会议秘书组 ”; 电话 : 0538 - 8242654, 8242456; 传真 : 0538 - 8242654, 8242456; 电子信箱同上。
山东农业大学
园艺科学与工程学院
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