全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(6)：678～682
Acta Horticulturae Sinica
利用 PCR技术 同时鉴定番茄抗根结线虫和抗斑 萎
病毒基 因
李君明 宋 燕 徐和金 周永健 Carole CaraJ1ta2 冯兰香
( 中国农业科 学 院蔬菜花 卉研 究所 ，北 京 100081； Institute National Breeding of Fruits and Vegetables，Monfavet Avignon
84143，France)
摘 要 ：利用同一 PCR反应体系，对分别与番茄抗根结线虫 的 基 因和抗斑萎病毒 (1w V)的 Sw一5
基因紧密连锁的 SCAR标记进行了同时扩增筛选 ，扩增 的特异性 片段与单引物扩增片段完全吻合 ，其中与
基因紧密连锁的 SCAR1标记为共显性标记 ，抗感试材均产生 750 bp的特异片段 ，纯合 和杂合抗病基 因
型试材存在 I酶切位点 ，酶切后分别产生了 570 bp、160 bp和 750 bp、570 bp、160 bp的不同特异性片
段 ，而感病基因型试材无 I酶切位点 ；与 Sw一5基 因紧密连锁的 SCAR2标记为显性标记 ，只有抗病试材
扩增 出 400 bD的特异性片段。经反复验证 ，结果稳定准确可靠 ，可用于在同一 PCR反应体 系中对两个抗病
基 因进行同时筛选鉴定。
关键词 i番茄 ；分子标记 ；PCR；Mi基因； 一5基因
中图分类号：S 641．2 文献标识码 ：A 文章编号：0513．353X (2003)06-0678—05
选育番茄多抗性品种一直是番茄育种的重要 目标 ]，根结线虫 (Meloidogyr~incognita)严重危害
我国保护地番茄生产l1j，番茄斑萎病毒 (Tomato Spoted Wilt Virus，删 )在我国云南等地 区频发，
台湾地区更为严重 ，可系统侵染粮食、蔬菜 、果树及花卉植物，引致斑块状褪绿 、黄化 、坏死及灼烧
等症状【引。番茄斑萎病毒病在国外发生也极其严重，1997年导致美国佐治亚州花生损失 4000多万美
元【引：传统的人工接种抗病性鉴定 ，不仅需要较长的时间和花费较多的人力物力 ，直接影响多抗性新
材料及新品种的选育进程，而且还易受环境条件、接种技术等影响，常常导致鉴定结果不稳定。新发
展的分子标记技术为早期抗病基因快速筛选鉴定提供了一项有力手段。本文利用 PCR技术对番茄抗
根结线虫和抗斑萎病毒两个抗性基因进行了同时鉴定筛选 ，可作为番茄多抗性新品种选育的一项快
速 、可靠的新技术。
1 材料与方法
1．1 试材
番茄 Moneymaker、Motelie、Movione、Mobaci、Moperou、Mospomor、Mogeor等试材 由法 国国立农业
研究院 (INRA)国家蔬菜果树遗传研究所提供 ，它们均是 以 Moneymaker为遗传背景且含有不同抗病
基因的近等基因系 ，其中对番茄根结线虫和斑萎病毒病的抗性基因型详列于表 I。2000年秋 ，利用上
述材料配制 了 Motele×Movione、Mogeor×Movione和 Mogeor×Motele等 3个杂交组合。番茄 Wva700、
CLN2037E等试材是从亚洲蔬菜研究发展中心 (AVRDC)引入 的新材料，分别含有抗晚疫病 一2、
Ph．3基因，Ailsa Craig(KA2838A)是从美国番茄遗传中心 (TGRC)引入的番茄试材 ，92155为作者选
育出的优 良加工类型新品系，00383是从保加利亚遗传研究所引入的含有雄性不育 ．2基因的新材
料 ，将其与 92155杂交配制了杂种一代 (00383×92155)。
1．2 引物
番茄抗根结线虫 施 基因的 SCAR标记正反引物参照 Wiliamson等 j设计 ，抗番茄斑萎病毒 Sw．5
收稿 日期 ：2003—04—19；修 回日期 ：2003—07—17
基金项目：国家自然科学基金项 目 (30100124)
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6期 李君明等 ：利用 PCR技术同时鉴定番茄抗根结线虫和抗斑萎病毒基因 679
基因的 SCAR标记正反引物参照 Chague等[ ]设计。引物序列及不同基因型材料的特异性扩增片段详见
表 1和表 2。引物均由上海生物工程技术公司合成。
表 1 不同抗病材料 Mi和 Sw．5基因的基因型及其 SCAR标记扩增的特异性片段
Table 1 Dif~ t G．删 pe respectively WitlI M／and Sw-5 g朗 es，and their印 ecial bands amplified by SC AR markers
注：INRA，法国国立农业研究院；IVF，CAAS，中国农业科学院蔬菜花卉研究所；AVRDC，亚洲蔬菜研究发展中心 ；TGRC，美
国番茄遗传中心。
Note：INRA： InstitutNational delaRechercheAgronomique；IVF， CAAS：Institute ofVegetables and Flowers， ChineseAcademy ofAgricultural
Sciences；AVRDC：Asian Veg etable Research and Development Center；TGRC：Tomato Genetics Resource Center．
1．3 DNA提取及单基因 PCR扩增体系
所有试材播种于温室 ，待幼苗长出4～5片真
叶时取叶片提取 DNA。DNA提取参照 Wiliamson
等【 ]方法 ，由 CTAB法提取 ，然后贮备在 一20~C
的冰箱中备用。
PCR反应总体系为 25tL，包括 Tris．HC1(pH
9．0)10mmol／L，KC150mmol／L，dNTP各 100tanol
表 2 引物名称及序列
Table 2 Pl恤 rs and sequences
引物 Primers 序歹 sequ∞c∞
5’． I℃GGAGCC兀1GGrr( AA 兀、．3’
5’一GCCAGAGATG椰 cGTGAGA．3
5’．CTGGG亿 AGTCITGACATIT一3’
5’．CTGGGTGAGTACA I℃AGATT．3’
／L，MgC12 1．5 mmol／L，1．0 U的 I DNA聚合酶 (上海普洛麦格生物产 品有 限公 司)，引物 0．2
tunol／L(上海生工生物工程技术公司)，模板 DNA加 ng，终体积用水加至 25 。用 PTC．200 PCR仪
(MJ，美国)进行扩增。其中用于扩增含有 基因的 PCR反应程序为：95c变性 5 min，然后 94oC 1
min、57oC 1 min、72oC 2 min进行 30个循环 ，最后72c延伸 7 min，扩增产物贮藏在 4~C保存。用于扩
增含有 ．5基因的 PCR反应程序为 ：94c变性 3 min，30个循环为 94c 1 min、55c 2 min、72c 2
min，最后 72~C延伸 2 min。PCR扩增产物于 1．5％琼脂糖胶，在电压 120 V条件下电泳 2 h，终结果用
EB染色 ，Bio-RAD凝胶成像系统显示。
1．4 双 引物 P( 扩增体 系
双引物反应体系仍然为 25 f』L，包括 s．HC1(pH 9．0)10 mmol／L，KC1 50 mmol／L，dNTP各 100
tunol／L，M．gC12 1．5 mmol／L，1．0 U的 DNA聚合 酶 (上海普洛麦 格生物产 品有 限公 司)，引物
SCAR1和引物 SCAR2各 0．6 pmol／L(上海生工生物工程技术公 司)，模板 DNA 20 ng，终体积用水加
至 25 f』L。在 FFC．200 PCR仪进行扩增。PCR反应程序是 94c变性 30 s，然后 94c 20 s、50oC 2 s、
72％ 2 min进行 35个循环，最后 72~C延伸 5 min。结果用 1．5％琼脂糖在电压 120 V条件下电泳 2 h，
终结果用 EB染色 ，Bio．RAD凝胶成像系统显示。
F R F R
m 刚 A A A A C C C CS S S S
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680 园 艺 学 报 30卷
1．5 酶切
番茄抗根结线虫 基因的 SCAR1标记为 显性 ，其 PCR产物需要酶切[ ，酶切体系为扩增产物
7 ，加入 5U的 I酶，用 Tris．HC1(pH 9．0)10 n~nol／L的缓冲液加到终体积 10 。反应体系在
PTC一200 PCR仪 65~C保温 l h。结果用 1．5％琼脂糖在电压 120 V条件下电泳 2 h，终结果用 EB染色 ，
Bio．RAD凝胶成像系统显示。番茄抗斑点萎凋病毒病 5 5基因 SCAR2标记为显性标记，抗病和感病
品种仅表现为扩增产物的有无 ，不存在 I酶切位点。
2 结果与分析
2．1 Mi基因特异片段的获得
图 la显示 ，利用 SCAR1正反引物扩增 全部
试材，无论是抗病材料还是感病材料均只扩增出
750 bp的特异性片段 ，经 I酶切后 (图 lb)，
抗病纯合基因型及杂合基 因型材料均存在酶切位
点，其中纯合基因型抗病材料 Motele和 Mogeor分
别产生了 570 bp和 160 bp大小的特异性片段 ，而
抗病 的杂合基因型 Motele×Movione和 Mogeor×
Movione等材料，分别产生了 750 bp、570 bp、160
bD的 3种不同片段，而感 病纯合基 因型 Money．
maker Movione、 Mobaci、 Moperou、 Mospomor
Wva700、CLN2037E等 l0份材料不能被 I酶切
开，仍然呈现原来的750 bp的片段。这与 Wilimnson
等【 j研究结果相吻合 。经多次重复试验 ，结果稳
定可靠 ，可用于番茄 抗病基因辅助选育。
2．2 Sw．5基因特异片段的检测
利用 SCAR2正反引物对全部试材扩增结果表
明 (图 2a)，只有含有抗病基因的 Mospomor品系
扩增出了产物为 4OO bp的特异性片段 ，而其它所
有感病材料均无 PCR产物 ，经 I酶切，不存
在 TaqI酶切位点 (图 2b)，这与 Chague等 4j研究
结果完全一致 ，即与抗病 Sw一5基 因紧密连锁的
SCAR标记表现为显性标记。
2．3 Mi和 Sw．5双基因 同时扩增
为了获得 可以同时对 和 Sw一5基因筛选的
PCR扩增 反应体 系，在原 各 自单 独引物稳 定的
PCR扩增体系的基础上，将 SCAR1和 SCAR2混合
引物在同一 PCR反应体系进行了扩增 ，通过对不
同引物 、底物 、酶等浓度的反复筛选 ，获得 厂可
以同时鉴定上述两个基因的扩增体系。如图 3a所
示 ，SCAR1引物扩增 出了原 750 bp的特 异性片
段 ，SCAR2引物扩增 出了 4OO bp的特异性片段。
图 3b为对应材料特异扩增产物经 raqI酶切后所
获结果。可以看 出无论是杂合还是纯合基因型抗
7501)1)
5701)1)
160bp
图 1 SCARI引物扩 增 P( 产 物 {a)和 I酶切后 结果 {b)
M MI和 M2：2000 bp、2000 bp和 6O0 bp的分子量大小标记，
1～15：代号 ，详见表 1
Fig．1 Products amplifed by SCAR1 primer{a)
and products cleaved by TaqI{b)
M， M1 and M2： molecular size mal~ers， 1—15：code， see table 1
枷
图 2 SCAR2引物扩增 P( 产物图 {a)
和 TaqI酶切后结果 {b)
M：2000 bp的分子量大小标记，1～15：代号，详见表 1。
Fig．2 Products amplifed by SCARI primer{a)
PcR products cleaved by TaqI{b)
M： molecular size malkeps， 1—15：code， see table 1．
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6期 李君明等 ：利用 PCR技术 同时鉴定 番茄抗根结线虫和抗斑萎病毒基因 681
病 、感病材料 ，均可扩增 出原单 引物所有 片段，
经重复试验，结果稳定。因此，成功地建立 了可
以同时对抗番茄根结线虫 的 基因和抗斑点萎
凋病毒病的 ．5基因稳定筛选的双基因 PCR标记
识别体系。
3 讨论
近几年随着分子技术的快速发展，利用分子
标记辅助选育已极大地加快了育种速度。以番茄
作为模式植物的研究极其广泛深入，国内外已获
得了与抗多种病害基因紧密连锁 的不同类型的分
子标记，这些标记为辅助育种提供 了有力工具。
SCAR标 记 作 为一 种 特 异 PCR标 记，不 仅 比
RFLP、AFLP等标记快速 、简便，并且不使用放
射性同位素 ，还比 RAPD等 PCR标记更稳定 、特
异性更强。共显性 的 SCAR标记 由于可 以区分杂
合体，获得较多的信息量，不仅可用于作图而且
图 3 SCAR1和 SCAR2双引物同时扩增 PCR产物 (a)
和 Taql酶切后结果 (b)
M1和 M2：2000 bp和600 bp的分子量大小标记，
1—15：代号，详见表 1。
Fig．3 PCR products simultaneotmly amplified by SCAR1 and
SCAR2 primers(a)PCR products deaved by Taql(b)
M1 and M2：molecular size markers． 1—15： cede．see table 1．
可有利于位点排列，而显性 SCAR标记由于只有单个扩增片段产物，似乎应用更为方便，扩增产物可
以省去电泳，直接加入溴酚蓝进行显色或者利用 ELISA酶标仪 、分光光度计等检测浓度进行结果判
断 J，由于 SCAR标记的特异性 ，已被广泛应用于各种作物辅助育种。
国外已有多引物 PCR研究相关报道 5 ，最近 Nebenfuhr等已成功利用多基因 RT．PCR体系对 L
基因家族的不同成员的表达进行了研究 _ ，但还尚未见利用多引物扩增进行番茄多个抗病基因标记辅
助选育的研究报道。本文建立的双引物扩增体 系是基于 Wiliamson等 j和 Chague等L4]筛选 的稳定
SCAR标记，扩增片段为原片段大小 ，它们和目标基因紧密连锁 ，在分离群体 中呈现明显的孟德尔遗
传规律 因此 ，本研究具有快速筛选 、鉴定各种番茄材料多基因的优点，可用于标记辅助育种 、品种
纯度及相关资源材料的鉴定 ，另外多引物扩增反应体系较单引物体系还可节省大量的人力 、物力 、大
大降低成本，为早期多基因鉴定及辅助育种提供了一项可行的技术。
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682 园 艺 学 报 30卷
Simultaneous Identification of M ulti-genes、 th Resistance Respectively to Root-
knot Nematode and TS、VV by PCR M arkers in Toma to
lJ Jurlnling ，Song yan ，Xu Hejin ，Zhou Yongjian ，Carole Caran~ ，and Feng 1．anxiang
( Institute of and Flowers，Chinese Academy ofAgr／cu／tura／Sc／ences，Being 100081，China； Institute National Breeding
ofFruits and Vegetables，Montfavet Avignon 84143，France)
Abstract：Single PCR reaction with two SCAR markers respectively tightly linkedwith M／an d Sw一5 genes in
tomato，which resistant to root—knot nema tode an d toma to spoted wi lt virus，has been used to screen the multiplex
ban ds．The PCR products with multiplex primers were completely correspond to the amplifed bands produced by
single SCAR primer．Among them，codominant SCAR 1 Balker tightly linked with Mi gene produce 750 bp flag—
ment in both resistant an d susceptible toma to lines．Th e am plified ban ds from susceptible an d resistant lines were
distinguishable after cleavage with the restriction enzyme I． Genotype with homozygous and heterozygous M／
gene could produce respectively 570 bp， 160 bp an d 750， 570 bp， 160 bp bands ． Susceptible genotypes stil
present 750 bp fragment．The dominant SCAR2 marker tightly linked with Sw一5 gene would produce only 400 bp
PCR product in resistant genotype．Th e replicated stable results pmved that two resistant genes could be identifed
simultaneously by using coresponding SCAR primer under adaptable condition．This system compared with single
primerPCR would be time saving， less labor and low cost． It could be very useful for marker—assisted selection
during early stage in tommo and efficiently speed up breed ing procedure．
Key words：Toma to； PCR； M／gene； Sw一5 gene
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