全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 (5) : 403~ 408
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2000- 11- 06; 修回日期: 2001- 04- 09
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39770076)
小分子热激蛋白基因在番茄花药中的转录
刘 箭1 庄野真理子2
( 1山东师范大学生物系 , 济南 250000; 2 日本国际农业科学研究中心, 日本石垣市 907)
摘 要: 选择 8 个耐热性不同的番茄品种种植在地处亚热带的日本最南部石垣市, 测定
夏季高温环境下花粉粒的败育率, 并据此将其分成耐热型和热敏型品种, 分析高温胁迫下花
药中 4 类小分子热激蛋白的转录。结果表明, 番茄花药中含有组成性的细胞质小分子热激蛋
白和线粒体小分子热激蛋白 mRNA; 高温季节细胞质小分子热激蛋白和线粒体小分子热激蛋
白基因转录明显; 热敏型番茄花药中小分子热激蛋白基因的转录高峰温度低于耐热型花药。
关键词: 小分子热激蛋白; 花粉; 败育; 高温胁迫; 番茄; 花药
中图分类号: S 641. 2; Q 785 文献标识码: A 文章编号: 05132353X ( 2001) 0520403204
花是植物对高温胁迫最敏感的器官。植物经轻度热激后, 营养组织通常不会出现明显
的伤害症状, 但花粉和子房的败育却十分明显112 , 高温胁迫导致花粉粒败育是热带和亚热
带地区蔬菜等作物减产的重要原因之一。遇高温胁迫时, 植物细胞在分子水平上最突出的
反应是热激蛋白的表达, 其中小分子热激蛋白 ( sHSP) 是主要热激表达产物, sHSP 可以
减缓蛋白质的热变性, 并促进热变性蛋白的复性122 , 所以 sHSP 被认为是提高植物细胞抗
热能力的重要原因之一13, 42。根据 sHSP 在细胞内的分布, 将其分成5类, 即定位细胞质的
Class I和 Class II、定位线粒体的 Class MT、定位内质网的 Class ER和定位叶绿体的 Class
CP sHSP112 , 除 Class CP sHSP以外, 其它 4类 sHSP都可在植物花药中表达。与丰富的大分
子热激蛋白研究资料相比, 植物花药中 sHSP 的研究资料相对较少, 虽然已经发现发育的
花粉小孢子有组成性表达的 Class I和 Class II sHSP15, 62 , 但还缺少 sHSP 在花药中表达的系
统研究, 更不清楚花药中表达的 sHSP 是否可以减少花粉粒的高温败育率。作者以番茄为
试材, 对此进行了探讨。
1 材料与方法
1. 1 材料
试验用 8个番茄品种, -桃太郎. 和 - Suncherry. 为日本品种, -红毛茄. 为泰国品
种, -CLN2026E. 、 - CLN2026C. 与 - UC204A. 由亚洲蔬菜研究与发展中心 (台湾省) 提
供, -毛粉. 与 -西粉. 为中国品种。3月 15日将番茄栽培于地处亚热带的日本最南部石
垣市, 整个栽培区覆盖塑料大棚, 模拟高温胁迫环境, 气温由电子仪器记录。从 5月 1日
(初花) 到 7月 23日 (进入当地的高温季节) 分 7次测定花粉粒的可育率, 7月 23 日 6、
10和 14时采集花药, 分析夏季白天气温上升过程中花药中 sHSP mRNA的累积。
1. 2 花粉粒可育性测定
取开花前的花药, 放入固定液 (乙酸B乙醇为 3B1) 中固定, 做简易压片, 用乙酸洋
红染色, 染色的花粉粒为可育。
1. 3 sHSP mRNA的 Northern杂交分析
1. 3. 1 RNA的纯化和 cDNA 探针的制备 摘取四分体时期的花药, 在液氮中研成粉末,
加入 1. 2倍体积的变性缓冲液 1异硫氰酸胍 4 mol/ L, 柠檬酸钠 26 mmol/ L ( pH 4. 0) , N2
laurylascosine 0. 5%, 巯基乙醇 0. 125 mol/L2, 再加入相当于变性缓冲液 1/ 10体积的醋酸
钠2 mol/ L ( pH 4. 0) , 混合均匀后, 加入等体积的酚/氯仿溶液 (酚B氯仿为 4B1) , 冰浴15
min, 偶尔振荡。离心分相后, 水相再用酚/氯仿萃取 1次, 水相与等体积的异丙醇混合,
- 20 e 放置 20 min, 离心后, RNA沉淀用 70% 的乙醇洗涤, 然后溶解在 DEPC处理的水
中, 加入 0. 33体积的 LiCl 8 mol/ L, 4 e 沉淀 6 h, 离心沉淀RNA, 沉淀的RNA用DEPC处
理的水溶解后, 再次用醋酸钠和乙醇沉淀 RNA, 沉淀出的 RNA溶解在二甲酰胺中, 储存
在- 80 e 的冰箱中备用。
用AlkPhos Direct (Amresham) 非放射性系统, 标记 Class II、Class ER (基因文库号:
AB260983)172、ClassMT sHSP (基因文库号: AB017134)132和 Class I cDNA (由美国亚利桑
拿州大学的E. Vierling教授提供) , 标记的探针用于Northern2blot分析。
1. 3. 2 Northern2Blot 将 20 Lg RNA经 1. 2%的甲醛琼脂糖电泳分离后转移至 Hyband2N+
尼龙膜上, 经紫外光固定后用非放射性AlkPhos Direct杂交系统 (Amresham) 进行 Northern
杂交。60 e 杂交过夜, 用 60 e 的洗涤液 (尿素 2 mol/L, SDS 0. 1%、pH 7. 0的磷酸缓冲液
50 mmol/ L, NaCl 0. 15 mol/ L, 阻断剂 0. 2 g/ L) 洗膜 2次, 每次 10 min, 再用Tris缓冲液
(Tris2HCl 0. 05 mol/ L, pH 10, NaCl 0. 1 mol/ L, MgCl2 0. 1 mol/ L) 洗膜 2 次, 每次 5 min,
在膜表面均匀涂一层高灵敏化学发光剂 CDP2Star (Amresham) , 用 X光片进行曝光。
2 结果与分析
2. 1 番茄品种花粉粒的高温败育率不同
1999年 5月 1日首次测定并分析番茄
花粉粒的可育性, 所有品种的可育率均为
100% , 电子温度记录仪显示, 从播种到 5
月 1日, 栽培区最高气温为 27 e ; 从 5月
1~ 14日, 最高气温为 30. 1 e , 5月 14日,
第2次测定花粉粒的可育性, 8 个品种仍
未发现花粉粒的败育; 5月 14~ 28日栽培
区的最高气温上升到 32 e , 5月 28日进行
第3次测定, 结果 8个品种均出现了不同
程度的花粉粒败育。此后数次测定结果表
明, 随着气温继续升高, 花粉粒败育越加
严重 (图 1) , 品种间花粉粒败育率的差别
也越来越明显。7月 23日进入高温季节,
图 1 夏季高温造成的不同番茄品种花粉可育率的变化
wCLN2026E p CLN2026C s 桃太郎 r 毛粉
v 红毛茄 @Suncherry o 西粉 u UC204A
Fig. 1 Pollen sterility of tomato under
high temperatur e st ress
wCLN2026E p CLN2026C s Momotaro r Maofen
v Hongmaoqie @Suncherry o Xifen u UC204A
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日最高和最低气温分别达 36 e 和 25 e , 此时 CLN2026C和 CLN2026E 的花粉粒可育率分别
为47%和 45%, 毛粉、西粉、红毛茄和桃太朗 4个栽培型品种的花粉粒可育率在 20%以
下, UC204A及 Suncherry extra花粉可育率几乎为零。因此我们认为 8个品种中, CLN2026C

图 2 田间高温条件下 8个番茄品种花药中 sHSP的转录
A~ H 分别代表番茄品种CLN2026C、CLN2026E、红毛茄、西粉、桃太朗、毛粉、UC204A和 Suncherry。
Fig. 2 The transcriptions of small HSP genes in the anthers of eight tomato variet ies
that were grown under the field condit ions of high temperature
A) H indicates the tomato cult ivars, CLN 2026C, CLN 2026E, Hongmaoqie, Xifen, House momotaro,
Maofen, UC204A and Suncherry, respect ively.
4055 期 刘 箭等: 小分子热激蛋白基因在番茄花药中的转录
和CLN2026E为耐热型, 其它均为热敏型, 而 Suncherry extra 和 UC204A 表现为极度热敏
感。
2. 2 耐热型与热敏型番茄花药中 sHSP基因热激转录模式不同
7月 23日 6、10和 14时的气温分别是28、32和 36 e , 此时分别采集四分体时期的花
药, 分析 sHSP mRNA 在花药中的累积, 结果当气温为 28 e 和 32 e 时, 耐热型番茄
CLN2026C和 CLN2026E的花药中 sHSP mRNA 累积相对较少, 气温从 32 e 上升到 36 e 时,
sHSP mRNA积累开始增加; 而热敏型番茄在气温从 28 e 上升到 32 e 时花药中的 sHSP
mRNA大量累积并达到高峰, 气温继续上升到36 e 时 sHSP mRNA的累积量反而减少。在夏
季高温环境下, 白天气温的上升过程中, 热敏型花药 sHSP mRNA表达的高峰早于耐热型
花药, 或者说热敏型花药中 sHSP mRNA表达高峰的温度低于耐热型花药。
由于 4种 sHSP cDNA探针长度相似, 又使用相同的 Northern杂交方法和杂交条件, 因
此4种 sHSP 的Northern信号的强弱反映了 mRNA 含量的差别, Northern杂交信号清楚地显
示, 花药中线粒体定位的ClassMT sHSP mRNA的含量最高, 而内质网定位的Class ER sHSP
mRNA的含量最低 (图 2)。
2. 3 番茄花药中存在组成性表达的 sHSP
用36 e 热激处理番茄植株 4 h, 然后移入28 e 环境中使其恢复, 采集在 28 e 下恢复的
番茄花药分析 sHSP mRNA的变化, 结果发现, 停止热处理 4 h后, sHSP mRNA已完全消
失, 说明热激后花药中 sHSP mRNA的降解很快132。利用电子温度记录仪对采样前 24 h以
及采样过程中的气温进行了监测, 发现 7月 22日 (采样前 1 d) 夜间 24时的气温已降到
28 e , 此后至次日 6时的气温低于 28 e , 即 7月23日 6时采样, 番茄植株经历了 6 h低于
28 e 的时间间隔, 根据上述对 sHSP mRNA降解速度的分析结果, 白天热激条件下转录的
sHSP mRNA已经完全降解, 因此 6时检测到的 sHSP mRNA为 28 e 正常表达产物。
5月 1日和 5月14日两次测定番茄花粉粒的可育率, 结果表明, 当最高气温为 30 e
时, 各品种的番茄花粉粒的败育率均为零; 5月 14日到 6月 11日, 最高环境温度上升到
32 e , 各品种番茄均出现不同程度的花粉粒轻度败育, 说明 30 e 是番茄花粉粒正常发育
的最高临界温度, 而 28 e 下花药中检测到的 sHSP 是组成性表达产物。
3 讨论
3. 1 花药发育过程中 sHSP 组成性表达的生物学意义
Class I182, Class II192和 Class MT132 sHSP 具有的体内和体外分子伴侣活性, 从机理上解
释了为什么 sHSP可以提高细胞的抗热性。Pr¾ndl等1102将HSF3 (热激转录因子 3) 导入野
生型拟南芥, 发现转基因拟南芥中 HSF3过量表达, 由此引发 HSP 在常温下大量表达。如
果突然用高温胁迫拟南芥, 转基因拟南芥显示出比野生型拟南芥更强的抗热能力, 说明增
加细胞内组成性热激蛋白的含量, 可以提高细胞抵抗突然热激的能力。同样, Lee 等1112利
用转HSF32GUS嵌合基因的方法也获得了类似结果。我们对常温下过量表达 ClassMT sHSP
的转基因烟草进行了耐热性分析, 发现在 ( CaMV) 35S启动子驱动下, 常温下 Class MT
sHSP表达并累积在线粒体内, 使转基因烟草细胞线粒体热稳定性高于正常的线粒体, 并
且转基因烟草的花粉粒的抗高温能力高于对照1122 , 说明 sHSP对提高植物花粉粒的抗热性
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具有一定的意义。本试验中, 我们除证实在发育的花药中有组成性表达的细胞质定位的
Class I和 Class II sHSP15, 62外, 还首次发现线粒体定位的 Class MT sHSP 也有较强的组成性
表达, 但我们没有从发育的花药中检测到组成性表达的内质网定位的 Class ER sHSP
mRNA。此外, 番茄花药中 sHSP 组成性表达强度还与品种有较大的关系。根据上述几个试
验结果, 我们认为花药中组成性表达的 sHSP 增加了细胞内热激蛋白的基础含量, 可减缓
因自然环境快速升温造成对高温极度敏感的花药的伤害。
3. 2 花药中 sHSP 的热激应答温度较低
通过分析番茄叶片中 sHSP的热激应答温度132 , 我们发现常温下番茄叶片中没有组成
性表达的 sHSP, 当环境温度高于35~ 36 e 时, 叶片中 sHSP 才开始表达。但对于番茄花药
而言, 在 28 e 下就有组成性表达的 sHSP, 环境温度上升到 32 e 时, 花药中 sHSP的累积明
显增加, 说明 32 e 即可引发了花药中 sHSP的热激表达, 但小分子热激蛋白在番茄花药中
的表达机理目前还不清楚。
3. 3 热敏型番茄花药中 sHSP 基因转录高峰温度较低的可能起因
我们曾对生长在 28 e 下的番茄进行短期热激处理, 发现番茄花药中 sHSP 的表达高峰
是40 e 132。而本试验是以田间条件下的番茄为试验材料, 在白天气温上升到 36 e 时, 热
敏型花药中 sHSP mRNA的转录强度反而降低 (低于 32 e 下的转录强度) , 说明进入高温季
节后, 热敏型花药中 sHSP 的高温转录机制已经受到了损伤。与热敏型花药相比, 田间条
件下耐热型花药 sHSP的热激应答模式与正常花药类似, 也说明耐热型花药的损伤较小。
另外, 36 e 下热敏型花药的 sHSP 转录强度下降, 是否导致高温下的花药缺少 sHSP 的
保护, 加重了热敏型花粉粒的高温败育, 也是值得进一步研究的问题。
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Transcription of the Small Heat Shock Protein Genes in Tomato
Anthers
Liu Jian1 and Mariko Shono2
( 1Department of Biology, Shandong Normal University, Jinan 250000; 2J apan International Research Center for
Agricultural Science, Ishigaki , Okinawa , Japan 907)
Abstract: Eight tomato cultivars with different heat tolerance were planted in the subtropical
area. The ratios of pollen sterile were checked in the summer. According to pollen sterility, the
tomato plants were classified into two types: heat tolerant type and heat sensitive type. Meanwhile,
the transcription of four types of small heat shock protein genes in tomato anthers were analyzed. The
const itut ive mRNA of cytosolic2 andmitochondrial2located small heat shock protein genes were detected
in the anthers. The significant heat induced transcription of cytosolic2 and mitochondrial2locted sHSP
genes occurred in the summer. The temperature corresponding to the sHSP transcription peak in
anthers of heat sensitive cult ivars was lower than that of the heat tolerance cult ivars.
Key wor ds: Small heat shock protein; Pollen; Sterility; High temperature stress; Tomato;
Anther
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