全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2003 , 30 (1) : 87～89
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2002 - 03 - 12 ; 修回日期 : 2002 - 07 - 23
甜樱桃茎尖培养及 PNRSV的 RT2PCR检测
代红艳1 　张志宏1 　吴禄平1 　侯义龙1 ,2 　吕德国1
(1 沈阳农业大学园艺学院 , 沈阳 110161 ;　2 大连大学生物工程学院 , 大连 116622)
摘 　要 : 研究了茎尖大小、接种方式、培养基成分、试材基因型对甜樱桃品种茎尖培养的影响。1 年
生成熟枝条上茎尖成苗率为8. 3 %～23. 7 % , 嫩梢上的茎尖成苗率为27. 3 %～37. 5 %。利用 RT2PCR 技术
对部分甜樱桃试管苗进行了早期病毒鉴定 , 筛选出一些不带李坏死环斑病毒 ( PNRSV) 的甜樱桃试管苗 ,
并证明甜樱桃试管苗微茎尖培养不能有效脱除 PNRSV。
关键词 : 甜樱桃 ; 茎尖培养 ; 病毒 ; RT2PCR
中图分类号 : S 662. 5 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2003) 0120087203
1 　目的、材料与方法
甜樱桃组织培养的研究始于 20 世纪 80 年代〔1〕, 其离体繁殖成功的报道〔1～4〕不多 , 这反映出甜樱
桃的离体繁殖比较困难 , 而且以往的报道均未涉及甜樱桃组培是否能够脱毒的问题。本研究以我国主
栽的和从国外引进的一些品种为试材 , 对影响其茎尖培养的多种因素进行试验 , 并利用逆转录多聚酶
链式反应 (RT2PCR) 技术对试管苗进行樱桃的主要病毒李坏死环斑病毒 ( Prunus necrotic ring spot
virus , PNRSV)〔5〕的检测 , 以期为我国甜樱桃无病毒苗工厂化生产积累经验。
甜樱桃 ( Prunus avium L. ) 试材取自大连市凌水镇和沈阳农业大学园艺学院温室 , 冬季取材为 1
年生成熟枝条 ; 夏季取材剪取嫩梢。品种有 : 红灯、乌梅早生、顽童、雷尼尔、砂蜜豆、高砂等。按
常规程序制作培养基。试材的消毒方法 : 洗涤剂水浸 3 min 后流水冲洗 60～90 min , 70 %酒精浸泡
30 s , 0. 1 %二氯化汞消毒 15 min , 无菌水冲洗 4 次 , 无菌水浸泡 20 min , 无菌水冲洗 4 次 , 接种。培
养条件为 : 温度 23～25 ℃, 光强 2 000～2 500 lx , 光照时间 16 h/ d。
甜樱桃叶片总 RNA 提取方法见文献 〔6〕。逆转录反应体系为 : Buffer ( 1 ×) , 引物 1 ( 5’
ACGCGCAAAAGTGTCGAAATCTAAA 3’) ( 1μmol/ L ) , 总 RNA 模板 (约 100 ng) , M2MLV 逆转录酶
(40 U) , dNTP (0. 25 mmol/ L) , RNasin (40 U) , MgCl2 (1. 5 mmol/ L) , 反应体积 10μL。逆转录反应
程序 : 37 ℃2 h , 95 ℃5 min 灭活逆转录酶 , 4 ℃保存。PCR 反应在 MJ PTC2150 热循环仪上进行 , 反应
体积为 25μL , 包括逆转录产物 10μL , 引物 1 和引物 2 (5’TGGTCCCACTCAGAGCTCAACAAAG3’) 各
1μmol/ L , dNTP (0. 2 mmol/ L) , Ex Taq 酶 2 U。, 程序为 : 94 ℃1 min , 55 ℃2 min , 72 ℃2 min , 35 个
循环 , 72 ℃5 min。扩增产物在1. 5 %琼脂糖凝胶中电泳 , 凝胶中含溴乙锭 , 浓度0. 5μg/ mL。
2 　结果与分析
2. 1 　取材时期和消毒接种方式对甜樱桃茎尖培养的影响
冬季和夏季两个时期枝条的茎尖均能分化成试管苗。夏季取材 , 可供接种的茎尖数较少 (顶端生
长点较适合于接种) , 但成苗率较高 (27. 3 %～37. 5 %) ; 冬季取材 , 枝条上可供接种的茎尖数较多
(顶芽和侧芽的生长点均可以接种) , 但成苗率低 (8. 3 %～23. 7 %) 。
以甜樱桃红灯品种 1 年生枝条为试材 , 研究了 3 种消毒接种方式对其茎尖培养的影响。处理 Ⅰ:
将单芽茎段纵切 , 对有芽部分进行消毒 , 接种时剥掉芽鳞片和外部叶原基 ; 处理 Ⅱ: 将芽从枝条上削
下来 (带一定木质部) , 去掉芽鳞片和茎表皮后消毒 , 接种时剥除外部叶原基 ; 处理 Ⅲ: 将芽从枝条
上切下来 , 不带木质部 , 剥除芽鳞片 , 消毒后直接接种。结果表明 : 处理 Ⅲ的污染率非常高 , 达
47. 4 % , 而且未污染芽也全部不能萌发 ; 处理 Ⅰ和处理 Ⅱ萌发率和成苗率差异不大 (萌发率分别为
75. 0 % , 71. 8 % ; 成苗率分别为 23. 3 % , 25. 0 %) , 但是处理 Ⅰ的污染率 ( 20. 0 %) 比处理 Ⅱ
(2. 5 %)高。综合来看 , 处理 Ⅱ效果最好。
2. 2 　基因型对甜樱桃茎尖接种成活率的影响
5 个甜樱桃品种的 1 年生成熟枝条茎尖相比 , 红灯的成苗率最高 , 达23. 7 % ; 砂蜜豆次之 , 为
18. 0 % ; 而雷尼尔、高砂、大紫较低 , 在 10 %左右。3 个品种夏季嫩梢的茎尖成苗率分别是 : 雷尼尔
37. 5 % , 顽童28. 6 % , 乌梅早生27. 3 %。
2. 3 　培养基成分对甜樱桃茎尖培养的影响
从基本培养基的种类和培养基中激素的种类两个方面进行试验。结果表明 : 基本培养基中大量元
素对甜樱桃茎尖的成苗率有一定影响 , 其中 MS 培养基效果最好。MS 和 WPM’ (WPM 大量元素 + MS
微量元素和有机成分) 培养基上的新梢状态相似 , 基部有瘤状愈伤组织 ; Knop’ ( Knop 大量元素 + MS
微量元素和有机成分) 培养基上的新梢基部发褐 , 无愈伤组织 , 而且叶片较小 , 叶色发黄。
通过比较 23 个激素配方发现 , 培养基中只以 BA 作为细胞分裂素物质效果不好 , 虽然茎尖可以
正常萌发 , 但是 1 个月以后多数出现枯顶现象 , 最终死亡 , 而附加一定浓度的 ZT后可大大提高茎尖
成活率。生长素类物质和赤霉素对于茎尖的初期分化培养不是必需的 , 但在继代培养过程中需要添
加。
2. 4 　甜樱桃试管苗的微茎尖培养
从甜樱桃试管苗上直接剥取的0. 5 mm 的微茎尖在附加激素的培养基上可以分化成苗。从表 1 可
以看出 , 试管苗微茎尖的成苗率很高 , 最高可达71. 1 % , 远远高于田间枝条茎尖的成苗率。比较
表 1 　甜樱桃试管苗微茎尖分化情况
Table 1 　Proliferation and shoot forming of minor shoot tip removed from in vitro plantlet of sweet cherry
浓度 Concentration (mg/ L)
BA GA ZT IBA TDZ LH
乌梅早生 Wumei zaosheng
接种数
No. of
inoculated
shoot tip
萌发率
Rate of
proliferation
( %)
成苗率
Rate of shoot
forming( %)
顽童 Wantong
接种数
No. of
inoculated
shoot tip
萌发率
Rate of
proliferation
( %)
成苗率
Rate of shoot
forming( %)
巨红 Juhong
接种数
No. of
inoculated
shoot tip
萌发率
Rate of
proliferation
( %)
成苗率
Rate of shoot
forming( %)
1. 0 4. 0 - 0. 1 - 200 48 97. 9 58. 3 99 58. 6 26. 3 49 89. 8 24. 5
1. 0 - 0. 3 0. 1 - 200 45 93. 3 71. 1 60 88. 3 60. 0 54 85. 2 51. 9
- - - 0. 1 2. 0 200 45 26. 7 22. 2 37 45. 9 21. 6 40 62. 5 22. 5
注 :培养基为 MS。Note :Medium were MS.
了 3 种培养基 , 其中以 MS + BA 1. 0 mg/ L + ZT
0. 3mg/ L + IBA 0. 1 mg/ L + LH 200 mg/ L 培养基比
较适合甜樱桃试管苗的微茎尖分化培养。
2. 5 　甜樱桃试管苗 PNRSV检测
从甜樱桃试管苗提取总 RNA 比从田间叶片提
取容易 , 而且 RNA 的提取量也较大。利用 RT2
PCR 技术可稳定地从甜樱桃试管苗中检测到
PNRSV (图 1) , 并鉴定出了 4 个品种的 15 个不带
PNRSV 的试管苗株系。从图 1 可以看出 , 甜樱桃
品种顽童的普通试管苗 (泳道 3) 和微茎尖培养
后获得的试管苗 (泳道 2) 均能扩增出大小为
449 bp 的 PNRSV 的特异片段 , 这表明利用试管苗
图 1 　利用 RT2PCR检测甜樱桃试管苗中的 PNRSV
M. DNA 分子量标记 , 1. 乌梅早生 , 2. 顽童试管苗
微茎尖培养获得的苗 , 3. 顽童 , 4. 高砂 , 5. 巨红 ,
6. 抉择 , 7. 早红宝石 , 8～12. 红灯的 5 个株系。
Fig. 1 　Detection of PNRSV in shoots in vitro of sweet cherry
M. DNA size marker , 1. Wumei zaosheng , 2. shoot regeneration
from minor shoot tip of Wantong , 3. Wantong , 4. Gaosha ,
5. Juhong , 6. Jueze , 7. Zao hongbaoshi , 8 - 12. Lines of Hongdeng.
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微茎尖培养技术并不能有效脱除 PNRSV。
参考文献 :
1 　Snir I. In vitro propagation of sweet cherry cultivars. HortScience , 1982 , 17 : 192～193
2 　Previewek2Kozlina B. Jelaska S. Microclonal propagation of Prunus avium L. Acta Hortic. , 1987 , 212 : 599～602
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4 　阎贤伟. 甜樱桃茎尖培养和快速繁殖研究. 园艺学报 , 1990 , 17 (4) : 275～280
5 　Kolber M , Nemeth M , Krizbai L , et al . Detectability of Prunus necrotic ringspot virus and Plum pox virus by RT2PCR , ELISA and indexing on
woody indicators. Acta Hortic. , 1998 , 472 : 243～247
6 　侯义龙. 果树主要病毒 RT2PCR 检测体系的建立、优化及病毒特异 DNA 片段克隆测序研究 : 〔博士学位论文〕. 沈阳 : 沈阳农业大
学 , 2000. 14
In Vitro Shoot Tip Culture of Sweet Cherry Cultivars and Detection of PNRSV
by RT2PCR
Dai Hongyan1 , Zhang Zhihong1 , Wu Luping1 , Hou Yilong1 ,2 , and LüDeguo1
(1 College of Horticulture , Shenyang Agricultural University , Shenyang 110161 , China ;　2 College of Biotechnology , Dalian University ,
Dalian 116622 , China)
Abstract : The effects of size of inoculated shoot tip , method of inoculation , medium and genotype on shoot tip
culture of sweet cherry ( Prunus avium L. ) cultivars were studied. The rate of shoots forming from tips of one2year2
old twigs was low , 8. 3 % to 23. 7 % , while the rate of shoots forming from tips of actively growing shoots was
higher , 27. 3 % to 37. 5 %. Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) was detected early in some of sweet cherry
plantlets in vitro with RT2PCR technique. Plants free of PNRSV were found. It was proved that PNRSV could not
be eliminated effectively from sweet cherry plantlets in vitro by culture of minor shoot tip .
Key words : Sweet cherry ; Shoot tip culture ; Virus ; RT2PCR
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