全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (6) : 811～813
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 02 - 13 ; 修回日期 : 2004 - 06 - 14
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30170643) ; 人事部回国留学人员项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail : wangxw @mail1caas1net1cn ; xieby @mail1caas1net1cn)
黄瓜花叶病毒反义 2b基因构建及其转基因初步研究
庄　木　王晓武 3 　谢丙炎 3 　杨宝军　方智远　黄和艳　郭淑华
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 研究构建了 CMV 反义 2b 基因的植物表达载体 pZM 612 , 通过农杆菌侵染的叶盘转化法导入烟
草 , 分子检测证实获得了转反义 2b 基因的 SR1 烟草转基因植株 , 初步的 CMV 攻毒试验表明反义 2b 基因可
介导对 CMV 的抗性。在此基础上 , 将 pZM 612 转化番茄品种‘红玛瑙 213’, 获得了卡那霉素抗性苗 , PCR
检测表明得到了 PCR 阳性转化株。
关键词 : 黄瓜花叶病毒 ; 反义 2b 基因 ; 转基因番茄
中图分类号 : S 64112 ; S 573 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0620811203
Construction and Transformation of An Antisense CMV 2b Gene
Zhuang Mu , Wang Xiaowu 3 , Xie Bingyan 3 , Yang Baojun , Fang Zhiyuan , Huang Heyan , and Guo Shuhua
( Laboratory of Biotechnology , Institute of Vegetables and Flowers , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081 , China)
Abstract : pBI1212based vector pZM 612 containing an antisense full2length 2b gene of CMV2BG was con2
structed and introduced into Nicotiana tabaccum var. SR1 , via Agrobacterium tumef aciens2mediated leaf2disc trans2
formation. The regenerated plants were screened by PCR , and further verified by PCR2Southern and one2step RT2
PCR. The results indicated that antisense 2b gene of CMV2BG had been integrated into the tobacco chromosomes ,
and expressed at transcriptional level . The resistance of transgenic plants was observed after viral infection , indicat2
ing the mediation of resistant to CMV2BG by the antisense 2b gene. The antisense 2b gene of CMV2BG (pZM 612)
was also introduced into Lycopersicon escuentum var. Hongmanao 213 , and PCR positive transgenic tomato plants
were obtained.
Key words : CMV ; Antisense 2b gene ; Transgenic tomato
1 　目的、材料与方法
黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus , CMV) 是危害十字花科、茄科、豆科及葫芦科等蔬菜作物
最主要的植物病毒之一。2b 基因是近十年来新发现的 CMV 基因组中与寄主植物相互作用的一个重要
功能基因 , 其表达产物 2b 蛋白是转录后基因沉默 (post2transcriptional gene silencing , PTGS) 的抑制子 ,
其存在可能是 CMV 寄主范围广泛的重要原因之一〔1～3〕。基于来自病毒的基因序列 (如外壳蛋白、复
制酶基因、运动蛋白等) 转入植物使植物获得对病毒抗性的成功实践与基因沉默研究的最新进展 , 预
示构建含 2b 基因的植物表达载体并转化植物 , 可能获得抗 CMV 的转基因植物。目前尚未见 CMV 2b
基因应用于抗病毒基因工程的报道 , 作者在此方面进行了初步探索。
植物材料为烟草 SR1 ( Nicotiana tobaccum var. SR1) 和番茄‘红玛瑙 213’ ( Lycopersicon esculentum
var. Hongmanao 213) 。病毒为来源于北京甘蓝的 CMV 分离物 (CMV2BG) 。
在获得 300 bp 的 2b 基因片段的基础上〔4〕, 扩增获得 CMV2BG的全长 2b 基因 (336 bp) , 转化到
pMD182T载体 , 以 Hind 和 Xba 从中切出携带 2b 基因的片段 (425 bp) , 通过 Sma 位点插入 pBI121。以
CaMV 35 S 启动子区引物 (p1) 分别和 2b 基因片段上链引物 (p2) 或下链引物 (p3) 组成引物对 , 验
证 2b 基因插入的方向 , 再经测序 (TaKaRa 公司) 进一步确认反义的重组克隆。将反义重组质粒按常
规的感受态细胞转化法转入农杆菌LBA4404 中 , 通过 Xba 和 Sac 双酶切验证 , 得到 CMV 反义 2b 基因
的植物表达载体 , 并命名为 pZM 612。
通过农感菌侵染的叶盘法 , 将 CMV 反义 2b 基因导入 SR1 烟草。对于表现卡那霉素 ( Km) 抗性
的再生转化植株 , 首先以 p2 和 p3 为引物对进行 PCR 扩增检测是否含有 2b 基因片段 , 进而利用 2b 基
因扩增产物为标记探针 , 参见试剂盒 (DIG DNA Labeling and Detection Kit ⅡRoche Cat . No. 1093657)
说明 , 进行 PCR2Southern 杂交检测。以转化株 RNA 为模板 , 进行一步 RT2PCR 检测 , 验证转基因植株
的 2b 基因转录。
将 SR1 烟草 PCR 阳性再生植株移栽到防虫温室中 , 待生长至 4～6 叶时按常规的摩擦法接种 CMV2
BG, 以未转基因 SR1 烟草无菌苗作为对照。接种后定期观察花叶症状的出现 , 每周统计 1 次。在接
种后的第 14 天 , 通过一步 RT2PCR 扩增检测 CMV CP 基因片段 (458 bp) 条带的有无 , 确定 CMV 的存
在与否。在此基础上 , 选择部分初次鉴定表现抗病的植株扩繁其组培苗 , 按同样方法做进一步的接种
鉴定。
番茄‘红玛瑙 213’种子经表面消毒后播种于 1/ 2MS 基本培养基上培养 , 取发芽 10～14 d 无菌苗
子叶 (去子叶柄) 作为转化材料 , 经农杆菌侵染的叶盘法导入反义 2b 基因。转反义 2b 基因番茄 Km
抗性植株的 PCR 检测 , 以 p1 和全长 2b 基因的上链引物 p4 组成引物对进行 PCR 扩增 , 检测目标基因
的插入。
2 　结果与分析
211 　CMV反义 2b 基因转入 SR1 烟草的分子检测和抗性分析
通过常规的酶切、连接及转化等程序 , 检测表明已获得了含反义全长 2b 基因的植物表达载体
pZM 612。将 pZM 612 转入烟草 SR1 , 提取已生根的 Km 抗性植株和未转基因植株 (负对照) 的叶片总
DNA , 进行 PCR 扩增检测 , 346 株再生植株中有 158 株表现 PCR 阳性 , 阳性株率为 46 %。采用地高辛
试剂盒 , 选取部分 PCR 阳性植株进行 PCR2Southern 检测 , 负对照无杂交信号 , 而正对照和被检测转化
株均得到了较强的 300 bp 目标杂交带。因此 , 可初步认为反义的全长 2b 基因片段已被整合到 SR1 烟
草的基因组中。
　　提取部分 PCR2Southern 阳性转基因 SR1 植株
的总 RNA , 以 p2 和 p3 组成引物对进行一步 RT2
PCR 检测 , 均得到了预期的 300 bp 目标带 (图
1) , 而非转基因植株未检测到特异性的转录产物 ,
表明整合到烟草 SR1 基因组中的全长反义 2b 基因
可转录为 mRNA , 但稳定状态的mRNA水平差异尚
需进一步通过 Northern 杂交来定量检测。
在初次接种 28 d 后没有表现花叶症状的 15
个转化株中 , 选取 5 个转基因植株和未转化的
SR1 进行扩繁 , 接种 CMV2BG。在接种 21 d 后负
对照全感病 ; 在接种 28 d 后 , B24、B308 和 B341
的全部植株均产生花叶症状 , B25 剩余 1 株没有
感病 , 而 B280 没有植株出现花叶症状 (表 1) 。
可初步证实部分 SR1 烟草转基因植株获得了对
图 1 　SR1 烟草 PCR2Southern 阳性转基因植株
的一步 RT2PCR检测
1 : 100 bp 梯度 DNA 标样 ; 2 : 负对照 (未转化 SR1) ;
3～7 : SR1 转 pZM 612 的 PCR2Southern 阳性植株。
Fig. 1 　One2step RT2PCR of SR1 PCR2Southern2positive
plants transformed with pZM 612
1 : 100 bp DNA ladder ; 2 : Negative control (mock2transformation
SR1) ; 3 - 7 : PCR2Southern positive plants.
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CMV 的抗性。
对于表现 CMV 抗性的转 CMV 反义 2b 基因植
株 , 其抗性机理可能是基于 PTGS 机制 , 转录的
2b 基因同源序列 , 与入侵 CMV 的 2b 序列在寄主
RNA 依赖的 RNA 聚合酶作用下形成双链 RNA , 启
动 RNA 特异性降解的 PTGS 进程 , 达到对 CMV 的
抗性 ; 也可能是由于转基因随机插入的不完整性
(表达盒不全) 、位置效应和拷贝数等不确定的原
因 , 致使反义 2b 基因异常或过量表达 , 干扰
或抑制了入侵 CMV 的 2b 基因表达或其蛋白的正
表 1 　转基因烟草对 CMV2BG的抗性分析 3
Table 1 　Phenotype of the selected transgenic plants against
CMV2BG infection
接种后天数
Days
postinoculation
侵染性 Infectivity days post2inoculation
负对照
Negative
control
- CK
转反义 2b 基因
Plants transformed antisense 2b gene
B24 B25 B280 B308 B341
14 5/ 6 1/ 3 0/ 2 0/ 3 3/ 4 2/ 3
21 6/ 6 3/ 3 1/ 2 0/ 3 4/ 4 3/ 3
28 6/ 6 3/ 3 1/ 2 0/ 3 4/ 4 3/ 3
　　3 感病株数与接种株数之比 Infected plants / inoculated plants
常功能 , 进而影响了 CMV 的入侵 , 产生了对 CMV 的抗性。上述推测尚需通过 Northern 杂交定量分析
转基因 mRNA 的转录表达 , 及其在细胞内积累量与抗病性的关系 , 并结合对 2b 蛋白的检测 , 获得相
关的分子证据支持。
212 　获得转 CMV反义 2b 基因番茄植株
　　以含植物表达载体 pZM 612 的农杆菌
LBA4404 菌液侵染番茄‘红玛瑙 213’的叶盘 20
～30 min , 将叶盘置于共培养基上暗培养 2～3 d ,
而后转到选择分化培养基上培养 , 20 d 左右即可
观察到叶片边缘长出愈伤或丛生再生芽。在分化
培养基上继代 1～2 次 , 将伸长的芽 (2～3 cm)
转到选择生根培养基上 , 得到了具有 Km 抗性的
幼苗。对生根的番茄 Km 抗性苗提取植物总 DNA
进行 PCR 扩增 , 结果在 6 株转反义 2b 基因的待检
测苗中有 5 株表现 PCR 阳性 (图 2) 。本研究虽获
得一些表现 PCR 阳性的转基因番茄植株 , 但仍需
进一步扩大转化群体 , 并进行分子验证和攻毒试
验后才可能获得有用的育种资源材料 , 这方面的
工作正在进行中。
图 2 　PCR检测转 pZM 612 的‘红玛瑙 213’再生植株
1 : 100 bp 梯度 DNA 标样 ; 2 : pZM 612 质粒 ; 3 : 负对照
(未转化植株) ; 4～9 : 转 pZM 612 再生植株。
Fig. 2 　PCR detection of L . escuentum var. Hongmanao 213
plants transformed with pZM 612
1 : 100 bp DNA ladder ; 2 : pZM 612 Plasmid ; 3 : Negative control
(mock2transformated plant) ; 4 - 9 : Transgenic plants with pZM 612.
参考文献 :
1 　Ding S W , Anderson B J , Haase H R , et al . New overlapping gene encoded by the cucumber mosaic virus genome. Virology , 1994 , 198 : 593～
601
2 　Brigneti G, Voinnet O , Li W X , et al . Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana . EMBO
Journal , 1998 , 17 (22) : 6739～6746
3 　Li H W , Lucy A P , Guo H S , et al . Strong host resistance targeted against a viral suppressor of the plant gene silencing defence mechanism. EMBO
Journal , 1999 , 18 (10) : 2683～2691
4 　庄　木 , 王晓武 , 谢丙炎 , 等. 我国不同 CMV 分离物 2b 基因片段的 RT2PCR 扩增及其序列比较. 植物病理学报 , 2003 , 33 (2) :
146～150
318　6 期 庄 　木等 : 黄瓜花叶病毒反义 2b 基因构建及其转基因初步研究