全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(2)：256～258
Aeta Horticulturae Sinica
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君子兰转化酶基因片段 (CMCt~)的克隆和序列分析
汪 琼 ， 王 燕 程水源 费永俊 金卫斌
( 扬州大学园艺系，扬州225009； 湖北农学院园艺系，荆州434025； 湖北农学院湖北省涝渍灾害与湿地农业重点
实验室，荆州 434025)
摘 要：分析植物酸性转化酶基因的保守区序列，设计一对PCR引物，以君子兰基因组 DNA为模板，
采用PCR方法扩增出长约500 bp的DNA片段，克隆入pGEM~-TEasy载体，测序结果表明获得君子兰酸性
转化酶基因家族的一个成员CMCW1，该基因片段长518 bp，不含内含子，编码 172个氨基酸。其序列已在
GenBank中登记 (登记号为AY151269)。在GenBank中进行同源性检索的结果表明，该成员编码的氨基酸
与其它植物细胞壁酸性转化酶编码的氨基酸同源性较高。
关键词：君子兰；转化酶；基因；克隆
中图分类号：S 68 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)02-0256-03
Molecular Cloning and Sequence of Acid Invertase Gene Fragments
(CMCW1)from Clivia miniata
Wang Qiong ，Wang Yan ，Cheng Shuiyuan ，Fei Yongjun ，and Jin Weibin
( Department ofHorticulture。Yangzhou University，Yangzhou 225009，China； Departme~ofHorticulture，Hubei Agricultural
Colege，Ji u 434025，China； Key Laboratory of Waterlogged Disaster and Wetland Agriculture in Hubei Province，ling-
zhou 434025，China)
Abstract：A pair of primers，designed from conserved regions of plant acid invertase genes，was used
to amplify same gene by polymerase chain reaction(PCR)．As a result，one 5 1 8 bp fragment was obtained，
and then cloned into pGEM~-T Easy and sequenced
．
It has no intron and encoded 172 amino acids． This
gene has been registered in GenBank with accession number AY15 1269． Th e deduced amino acid sequence is
higher identical to the gene from other plan t．
Key words：Clivia miniata；Invertase；Gene；Cloning
1 目的、材料与方法
有关番茄和胡萝卜等作物转化酶基因植株的研究表明，改变转化酶活性会影响光合能力、光合产
物的运转分配乃至植株生长、果实大小、品质、产量和育性l1 j。目前已从甜菜、马铃薯、拟南芥、
烟草、玉米、胡萝 卜、番茄以及绿豆等植物中分离到该酶编码基因。但对草本花卉来说，尚未有这方
面的报道。作者以君子兰 (Clivia miniata Roge1)为材料，克隆该基因，以期为探讨该基因在君子兰
植株发育过程中的作用及为进一步通过转基因研究改善君子兰植株根冠比性状奠定基础。
试验以大花君子兰品种 ‘大胜利’幼叶为材料，采用 CTAB法提取基因组DNA，根据 GenBank
登记的其它植物酸性转化酶基因序列 (玉米 AFIM3346，拟南芥 Ul1033，蚕豆 Z35162，胡萝 卜
X78423，马铃薯Z22645，烟草 X81834，番茄AB004558和豌豆X85327)的保守区设计一对 PCR引
物，其中上游引物：5-TACCATCTATFCTACCAGTACAA一3’；下游引物：5-AAAAAATCAGGACACTC．
收稿日期：2003—04—24；修回日期：2003—07—28
基金项目：湖北省涝渍灾害与湿地农业重点实验室开放基金资助项目 (HNKFJ2002B03)
}通讯作者 Corresponding auger
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2期 汪 琼等：君子兰转化酶基因片段 (CMCW1)的克隆和序列分析 257
CCACAT．3’。通过PCR方法克隆转化酶基因，PCR
产物经纯化后与pGEM~-T Easy载体连接，连接产
物转化大肠杆菌TG1菌株感受态细胞，通过蓝白斑
筛选 质粒长度和酶切鉴定获得重组质粒 。DNA
序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司测
序。
2 结果与分析
2．1 PCR产物的扩增和克隆
以君子兰基因组 DNA为模板，用所设计的引
物进行 PCR反应，得到预计长度大约为 520 bp的
条带，将经纯化后的PCR产物与pGEM@一T Easy载
体连接，连接产物转化大肠杆菌TG1菌株感受态细
胞，在含氨苄青霉素、X．gal及IPTG的 LB平板上
涂布获得白色菌落，挑取这些菌落培养、提取质粒，
经长度和酶切 (EcoR I)鉴定获得重组质粒 (图 1)。
2．2 基因序列与同源性分析
bp
2OOO
l0OO
750
5OO
2OO
lOO
1 2 3 4 5
图1 PCR扩增片段重组入 pGEM~-T Easy载体
1．DL．2000 Marker；2．PCR产物；3．pBS质粒；
4．重组质粒；5．EcoRI酶切产物
Fig．1 Cloning of amplifed fragment into pGEM ~-T
DL一2000 Marker；2．PCR product；3． pBS；4．Recombinant
plasmid：5．Recombinant plasmid digested with EcoR I
测定重组质粒的序列，表明所克隆的片段长518 bp，编码172个氨基酸，属于开放阅读框的一部
分，不含内含子，其序列 (如图2)已在GenBank中登记 (登记号为AY151269)。
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图2 君子兰细胞壁酸性转化酶基因部分序列
划线部分为引物序列
Fig．2 Partial nudeotide and deduced alilin0 acid sequence ofC／v／aminiatainvertase gene
~qlerlces homologous to the oligonucleotide primers used for PER amplifcation afe underlined
在GenBank中进行Blast检索结果表明，该基因片段编码的氨基酸与植物细胞壁酸性转化酶基因
编码的氨基酸具有较高的同源性，与豌豆bfructl(AF063246)、草莓，Ⅳ (AFO00521)、胡萝 卜Inv
Dcl(X69321)、玉米／nCWI和／nCW3(AF050129和AFIM3346)细胞壁酸性转化酶的同源性分别为
62．79％、56．98％、56．98％、58．42％和56．40％ (图3)，推测其属于君子兰细胞壁酸性转化酶基
因，因此称之为CMCW1。
该基因片段的获得对于进一步通过Northern杂交等手段探索君子兰细胞壁转化酶基因在君子兰植
株生长发育过程中的作用具有重要的意义，并为将来通过基因工程改良君子兰形态奠定了基础。
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258 园 艺 学 报 3l卷
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图3 不同檀韧细胞壁转化酶基因氨基酸序列比较
表示相同的氨基酸基团
Fig．3 s|q岬 comparison of ceH wal invertase like proteins
Represents identical residue
参考文献：
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6 Sambrook J，Fritseh E F，Maniatls T著．分子克隆实验指南．第2版．金冬雁，黎孟枫译．北京：科学出版社，1995．1062页
该书于2001年 1月由美国冷泉港实验室出版社出版，三卷本，大 l6开，平装，
2100页，比1O年前的第二版增加近450页，内容经过了全面改写与更新，是当今生命
科学领域的重要工具书。各卷目录为：
Vohmm 1：1．Plasmids and Their Usefulness in MoleeulIt．1"Cloning：2． Bacte．riopghage
lambda and Its Vectors；3．Working with Bacteriophage M13 Vectors；4．Working with HiSh·
capacity Vedom：5．Gel Eleetrophoresis of DNA and Pulsed-field Agarese Gel Eleetrophore．
sis；6．Preparation and Analysis of Eukaryotie Ge nomie DNA；7． Extraction，Purifcation，
and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cels
Volt,me 2：8．In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction；9．Preparation of Radiolabeled DNA and
RNA Probes；10．Working with Synthetic Oligonueleotide Probes；11．Preparation of eDNA Libraries and Gene Identifcation；
12．DNA Sequencing；13．Mutagenesis；14．Screening Expression Libraries
Volm e 3：15． Expression of Cloned Ge nes in Escheriehia eoli；16．Introducing Cloned Ge nes into Cultured Mammalian
Cels；17．Analysis of Gene Expression In Cultured Mammalian Cells；1 8
． Protein Interaction Technologies Appendices
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一～一～删一
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