全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 2) : 128~ 132
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2000- 07- 24; 修回日期: 2000- 10- 08
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39870512)
部分工作在浙江大学国家蔬菜重点学科细胞与分子生物学实验室完成, 特此致谢。* 通讯联系人。
乙烯受体基因 LeETR1在番茄突变体 Epi及
其野生型中的表达
郑铁松1 应铁进1* 何国庆1 曹家树2
( 1浙江大学食品科学与营养系, 杭州 310029; 2 浙江大学园艺系, 杭州 310029)
摘 要: 采用核酸酶保护分析 ( RPA) 方法对番茄乙烯过表达单基因突变体 Epi和野生型
VFN8中 LeETR1 mRNA 的表达特征进行了研究。结果表明, 在正常番茄中 LeETR1 mRNA 不受
内源乙烯含量的影响, 呈组成性表达。LeETR1 mRNA 在 Epi部分组织中的表达强度发生了改
变, 并与 Epi的形态特征变化相吻合, 提示 LeETR1 在叶片的形态建成、果实成熟和顶钩发育
中可能起着重要的作用。
关键词: 番茄; 乙烯受体; LeETR1; 核酸酶保护分析; 基因
中图分类号: S 641. 2; Q 786 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 02012805
乙烯是调控植物生长发育、成熟衰老的重要激素, 从种子萌发、叶片衰老、根茎伸长
到果实成熟与软化等无不为乙烯所调节。随着植物体内乙烯生物合成途径的阐明和分子生
物学的深入研究, 通过分子生物学途径调控植物内源乙烯的合成已取得了显著的成绩。但
相比而言, 乙烯受体系统的研究则刚刚起步。在拟南芥乙烯受体基因研究的基础上, 最近
在番茄上也分别克隆到了与拟南芥乙烯受体基因 ETRI、ERS 和 ETR 2同源的 LeETR1、
LeETR2、NR、LeETR4和 LeERT5等 5个乙烯受体基因1~ 4 。但目前尚不了解这些基因在
整个乙烯受体系统中的确切功能, 因而难以实现乙烯受体基因调控的实际应用。
Epinastic ( Epi) 是美国加州大学的 Bradford于 1984年在番茄品种 VFN8群体中发现的
一个乙烯过表达的单基因突变体, Epi的表现型与其野生型亲本有着极大的差异5 。我们
拟通过研究 Epi及其野生型中 LeETR 1基因的表达特性, 对该基因在番茄乙烯受体系统中
的功能进行初步探索。
1 材料与方法
1. 1 供试植物材料
番茄 ( Lycopersicon esculentum Mill. ) Epi和VFN8种子由美国加州大学番茄种子中心提
供。按常规方法栽培于温室中。记录从花药开放到果实破色 ( BK, 即果面出现第一丝转
红) 的平均天数 (样本大于 80个果实)。分别采集处于未成熟期 ( I)、绿熟期 ( M)、BK
期、BK+ 3 d、BK+ 5 d、BK+ 7 d和 BK+ 10 d的果实, 处于幼叶期 ( a)、展开期 ( e) 和
成长期 ( m) 的叶片作为代表各发育阶段的样品, 进行指标测定。
1. 2 果实有效货架寿命和乙烯含量的测定
参照 Jackman6 的方法, 果实有效货架寿命定义为果肉组织生物屈服点 ( bioyield point)
下降 50%所需要的时间。内源乙烯生成量按文献 7 方法测定。
1. 3 LeETR1 cDNA部分序列的克隆与鉴定
依照 Grierson等8 的方法从测试植物中抽提总 RNA。用目的基因的3! - 端序列为引
物, 以 MMLV反转录酶从组织总 RNA中反转录合成目的基因的 cDNA第 1链, 以此为模
板, 用 PCR法合成目的基因的 cDNA部分序列, 用 Original TA Cloning克隆试剂盒 ( Invi
trogen UK) 将纯化的 cDNA 序列插入 PCR2. 1克隆载体中, 转化大肠杆菌 TOP10F! 。以
LacZ- 互补法筛选阳性菌落, 并以 PCR2. 1质粒中带有T 7启动子序列和目的基因 cDNA
3! - 部分序列为引物, 用 PCR法筛选正确方向插入的菌落, 然后对克隆的 cDNA序列进行
测序鉴定。
1. 4 核酸酶保护分析 ( RPA)
采用 RPA分析的方法测定 LeETR 1 mRNA 在植物组织中的表达丰度。采用专用的核酸
酶RNase ONETM试剂盒 ( Promega, USA) 并按其提供的方法9 进行。以含有目的基因的
cDNA克隆质粒为模板, 用T 7 RNA聚合酶合成的含有32PUTP 的 RNA为探针。
2 结果与分析
2. 1 Epi和 VFN8植株的形态特征
Epi是从 VFN8群体中发现的天然乙烯过表达突变体5 。在正常生长条件下, Epi的幼
苗从子叶展开到第3片真叶期与VFN8差别不大, 至 4~ 5片真叶时开始表现乙烯过表达的
形态特征, 叶片发生严重的偏上生长, 导致极为紧凑的植株形态。遮光生长时, Epi的表
现型仍呈严重的部分三重反应: 遮光幼苗
上胚轴显著变短变粗, 根系略变短, 但上
胚轴顶钩角明显小于 VFN8 ( Epi: 50∀ #
42∀; VFN8: 128∀ # 60∀)。Epi和 VFN8果实
生长发育速度无明显差异, 但后熟特性差
异较大, 以果实生物屈服点下降 50%为指
标, 在 20 ∃ 下 Epi成熟果实的有效货架寿
命为 4~ 5 d, 而VFN8则为 10 d以上。
2. 2 Epi和 VFN8果实中乙烯的合成
Epi果实中乙烯的生成量始终高于其
野生型 VFN8 ( p % 0. 01) , 在绿熟期为
VFN8的 4倍以上, 在 BK+ 5 d期为 VFN8
的1倍 (图 1)。在营养生长中也有类似现
象, 如 Fujino5 的研究表明, 在 14、19、
25、31日龄的植株中, 组织乙烯含量 Epi
分别比 VFN8 高 250%、80%、172% 和
图 1 Epi和 VFN8番茄果实中乙烯生成量 ( n= 5)
I: 未熟期; M : 绿熟期; BK: 破色期;
3: BK+ 3 d; 5: BK+ 5 d; 7: BK+ 7 d; 10: BK+ 10 d
Fig. 1 The ethylene production of Epi and VFN8
in their fruit ( n= 5)
The endogenous ethylene product ion of Epi and VFN8 fruit s
was measured at different growth stages: immature ( I) ;
mature (M ) ; breaker ( BK) ; 3, 5, 7, 10 days
after breaker ( 3, 5, 7, 10)
1292 期 郑铁松等: 乙烯受体基因 LeETR1 在番茄突变体 Epi及其野生型中的表达
307%。
2. 3 Epi和 VFN8果实中 LeETR1 mRNA 的表达特性
采用 RPA 方法对 Epi 和 VFN8中 LeETR1 mRNA 的表达丰度检测结果表明, LeETR1
mRNA在二者果实发育的各个时期都有一定的表达, 其表达丰度随着果实发育略有增加和
波动, 但在表达量上没有明显差别, 即在 Epi和 VFN8果实中 LeETR1 mRNA基本呈组成性
表达模式。将绿熟果用外源乙烯处理 ( 10 L&L- 1, 24 h) 后, Epi绿熟果中 LeETR1 mRNA
的丰度明显高于同批处理的VFN8绿熟果, 提示二者对外源乙烯的敏感性可能不同(图 2)。
图 2 Epi 和VFN8番茄果实中 LeETR1 mRNA的积累模式
左图为 LeETR1 mRNA 的RPA分析放射自显影图, 右图为相对表达强度图。
E: Epi; V: VFN8, I: 未成熟期果实; M: 成熟期果实; BK: 破色期果实; 3、5、7、10分别表示破色后
3 d、5 d、7 d、10 d的果实; G: 用外源乙烯处理 ( 10 L&L- 1, 24 h) 的绿熟果实; D : 用酶水解后
的探针; U : 未用酶处理的探针; VI 和 EI 分别表示Epi和VFN8未成熟期果实, 其余类推。
Fig. 2 LeETR1 mRNA expression in fruit of Epi and VFN8
The levels of LeETR1 mRNA were measured by RPA analysis and detected by Xray radioautograph ( left ) and compared
quant itat ively to give the percentage relative expression ( right ) . RPA analysis was performed on total RNA from fruit s of Epi (E)
and VFN8 ( V) at different growth stages: immature ( I) ; mature (M) ; breaker ( BK) ; 3, 5, 7, 10 days after breaker ( 3, 5,
7, 10) and mature green fruits treated with ethylene 10 L&L- 1, 24 h ( G) . Digested probe ( D) ; Undigested probe (U) .
图 3 LeETR1 mRNA 在 Epi 和VFN8叶片中的累积模式
左图为 LeETR1 mRNA 的RPA分析放射自显影图, 右图为相对表达强度图。
V: VFN8; E: Epi; a: 幼叶期; e: 展开期; m: 成长期; U : 未用酶处理的探针;
D: 用酶水解后的探针; Va、Ea 分别表示处于幼苗期的 VFN8和Epi叶子, 其余类推。
Fig. 3 LeETR1 mRNA expression in leaves of Epi and VFN8
The levels of LeETR1 mRNA were measured by RPA analysis and detected by Xray radioautograph ( left ) and compared
quantitatively to give the percentage relat ive expression ( right) . RPA analysis was performed on total RNA from leaves
of Epi (E) and VFN8 (V) at diff erent growth stages: apical ( a) , expanding ( e) , mature ( m) .
130 园 艺 学 报 28卷
2. 4 Epi和 VFN8叶片中 LeETR1 mRNA 的表达特性
与果实中的表现不同, 在 Epi和VFN8的叶片中 LeETR1 mRNA的表达丰度随着叶片的
发育表现出明显不同的表达模式。在VFN8 中 LeETR 1 mRNA的表达随叶片的成长虽然略
有下降, 但基本恒定; 而 Epi中的表达丰度变化剧烈, 在叶片成长期 LeETR1 mRNA 表达
丰度明显高于叶片展开期 (图 3)。
3 讨论
无论在果实还是在叶片的发育中, Epi中的乙烯合成量均明显高于VFN8, 但 LeETR1
mRNA的表达丰度在所检测的大部分组织样品中, Epi 均与 VFN8 无明显差异, 说明
LeETR1 mRNA在正常番茄发育中呈组成性表达模式, 基本不受内源乙烯含量的影响。这
与NR 基因的诱导型表达模式2 明显不同, 说明 LeETR1和 NR 可能分属不同的乙烯受体
系统, 它们在番茄乙烯信号的传导中起着不同的作用。
在生长期的叶片和外源乙烯处理的绿熟期果实中 LeETR 1 mRNA 的表达丰度, 突变体
Epi明显高于野生型VFN8。试验结果表明, 在营养生长时期, Epi与VFN8的差异主要体
现在成熟叶片的形态上; 而在果实发育上, 则主要体现在 Epi果实成熟的明显加快。发育
中的这些异常特征刚好与其 LeETR1 mRNA 丰度的异常表达相吻合。由此可以推测, 乙烯
受体基因 LeETR 1可能在番茄的这些形态建成过程起着特殊的作用。这一研究结果为确定
LeETR1的功能提供了新的依据。而 Epi和 VFN8绿熟果中 LeETR1 mRNA 表达丰度在自然
状态下基本相当, 但在外源乙烯处理后则明显不同, 提示 Epi位点的突变可能影响到乙烯
对 LeETR1表达的调节作用, 具体原因还有待于进一步探讨。另外部分营养组织中 LeETR1
的表达丰度也发生了变化 (图 3) , 这可能与 Epi幼苗顶钩形成上丧失乙烯敏感性有关。
目前在拟南芥和番茄上均已经发现了多达 5种以上的乙烯受体, 它们在分子结构和表
达特性上都具有明显差异1~ 4 。已有证据表明, 乙烯对植物三重反应、植株发育和果实成
熟的影响是通过不同的信号通道实现的10 。如拟南芥突变体只是在顶钩形成时对乙烯失
去敏感性, 而其它乙烯反应则正常11 ; 番茄 NR 突变体则表现为多效性, 除果实成熟受
阻外, 还表现为叶柄偏向生长反应下降, 叶片衰老和脱落延迟等12 ; LeETR 4在番茄果实
中表达丰富而 LeETR 5则极少表达1 。总之, 植物体内乙烯的感受和传导系统是极其复杂
的, 各种乙烯受体在植物发育过程中表达特性不同, 可能起着完全不同的作用。
参考文献:
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Expression of Ethylene Receptor Gene LeETR1 in Tomato Mutant Epi
and Its Wild Type
Zheng Tiesong
1
, Ying Tiejin
1
, He Guoqing
1
, and Cao Jiashu
2
( 1Department of Food Science and Nutriology , Zhej iang University , Hangzhou 310029; 2Department of Horticulture,
Zhejiang University , Hangzhou 310029)
Abstract: The expressive characteristics of LeETR1 mRNA in tomato mutant Epi and its wild
type VFN8 have been studied with RNase protect assay ( RPA) . The results showed that LeETR1
mRNA expressed constitutionally in VFN8. And its expression was not affected by the endogenous pro
duction of ethylene. However, the high expression of LeETR1 in some tissues of Epi suggested that
LeETR1 gene may have an important role in the morphogenesis of leaves, apical hooks and fruit
ripening in tomato.
Key words: Tomato; Ethylene receptor; LeETR1; RPA; Gene
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