全 文 ：第 17 卷
第 6 期

Vol. 17
No. 6
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
11 月

Nov.

2009
散穗高粱与苏丹草杂种的 ISSR分析
周亚星, 于 卓* , 马艳红, 李晓宇, 李长青, 李小雷, 纪明妹
(内蒙古农业大学农学院 , 呼和浩特
010019 )
摘要: 为明确散穗高粱( Sorghum bicolor ( L . )与黑壳苏丹草、白壳苏丹草、棕壳苏丹草、红壳苏丹草 4 个种间杂种
F1 在 DNA 分子水平上的差异程度, 利用 ISSR 分子标记技术对散穂高粱与 4 种苏丹草 ( S. sudanense ( P iper )
St apf)杂种 F1 及其亲本间的多态性进行分析。结果表明: 14 个 I SSR 适宜引物共扩增出 451 条带, 其 DNA 片段长
度为 200~ 2000 bp, 多态性条带 416 条, 多态性条带百分率为 92. 2% ; 9 个供试材料间的遗传距离 ( GD)变幅为
0. 1818~ 0. 7838, 平均为 0. 6892;散穗高粱与红壳苏丹草 GD值较大, 而与白壳苏丹草 GD 值较小; 以 GD 值 0. 44
为基准, 9 个材料聚为 3 类:第一类为散穗高粱、棕壳苏丹草、黑壳苏丹草、白壳苏丹草, 第二类为散穗高粱
黑壳苏
丹草 F1、散穗高粱
白壳苏丹草 F1、散穗高粱
红壳苏丹草 F1、散穗高粱
棕壳苏丹草 F 1 ,第三类为红壳苏丹草。
关键词:散穂高粱; 苏丹草;种间杂种 F1 ;遗传差异; ISSR分析
中图分类号: S334; Q943. 2



文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2009) 06
0718
05
ISSR Analysis of Hybrids of Loose Spike Sorghum and Sudangrass
ZHOU Ya
xing, YU Zhuo* , M A Yan
hong, LI Xiao
yu, LI Chang
qing, LI Xiao
lei, JI M ing
mei
( Colleg e of Agronomy, In ner Mongolia Ag ricultural University, Hohhot, Inner M on gol ia Autonomous Region 010019, Ch ina)
Abstract: In or der to define the genet ic dif ference deg ree in four hybrids F 1 betw een loo se spike sor ghum
and black hull sudang rass, w hite hull sudang rass, br ow n hull sudang rass and r ed hull sudang rass and pro

v ide evidence for marker
assisted select ion and breeding as w ell as heterosis evaluat ion and ut ilizat ion of the
pro genies, the po lymo rphism among hybr ids F 1 betw een loose spike sorghum and 4 kinds o f sudang rass
and their parents w er e analyzed using ISSR mo lecular maker. T he results show that 451 bands of ISSR
marker s w ere amplif ied w ith 14 suitable pr imer s, and the leng th o f DNA fragment w ere ranged fr om 200 to
2000bp; 416 bands w ere po lymo rphic, and the per centage of po lymor phism bands reached 92. 2%. The ge

netic distance ( GD) of 9 tested plants were ranged fr om 0. 1818 to 0. 7838, and the aver age genet ic distance
w as 0. 6892. The genet ic distance betw een loose spike so rghum of and red hull sudangrass w as larg er , and
that betw een loose spike sorghum and white hull sudangrass w as the smaller . U sing the GD value of 0. 44
as threshold, 9 tested plants could be cluster ed into 3 gr oups: the f irst g roup including loose spike sor

ghum , brow n hul l sudang rass, black hull sudang rass, and white hull sudangrass; the second g roups inclu

ding four hybrids F 1 betw een loo se spike sorghum and 4 kinds of sudang rass; the third g roups including
red hull sudang rass.
Key words: Loose spike sorghum ( S orghum bicolor ( L. ) M oench) ; Sudangrass ( S . sudanense ( P iper)
Stapf) ; Interspecies hybr id F 1 ; Genet ic dif ference; ISSR analysis


高粱( S orghum bicolor ( L . ) Moench)是重要
谷类作物之一, 其生态适应性广,具有高产、抗旱、耐
寒、耐涝、耐盐碱等特性。苏丹草 ( S. sud anense
( Piper) Stapf )原产北非,是当前世界上栽培最普遍
的一年生禾本科饲草, 其茎叶品质比青刈玉米和高
粱柔软,适口性好,再生性强[ 1~ 5]。高粱与苏丹草杂
交不存在遗传障碍, 二者的杂交后代一般称作为高
丹草,其杂种优势强大[ 6~ 13] 。为培育优质、高产、抗
逆性和适应性强的高丹草新品种(高粱
苏丹草杂
交品种) ,我们利用散穗高粱与在内蒙古中西地区种
收稿日期: 2009
08
06;修回日期; 2009
11
06
基金项目:国家重点基础研究发展计划( 973计划) ( 2007CB108901) ;国家自然科学基金( 30960262) ;国家科技部农业科技成果转化资金
( 2008GB2A400042) ;内蒙古自然科学基金重大项目( 200711020301) ;内蒙古草业研究院专项( 20071923)
作者简介:周亚星 ( 1981
) ,女,河北石家庄人,博士研究生,研究方向为饲用作物遗传育种, E
mail: z houyax ing3@ 163. com; * 通讯作者
Author for correspon dence, E
m ail: yuzh uo58@ sina. com
第 6期 周亚星等:散穗高粱与苏丹草杂种的 ISSR 分析
植多年的黑壳苏丹草、白壳苏丹草、棕壳苏丹草、红
壳苏丹草相组配进行人工授粉杂交,成功获得散穂
高粱
黑壳苏丹草、散穂高粱
白壳苏丹草、散穂高
粱
棕壳苏丹草、散穂高粱
红壳苏丹草 4个杂交
组合 F 1代。
ISSR ( Inter
Simple Sequence Repeats, 简单序
列重复区间扩增多态性)是一种新型的分子标记技
术,它是在 SSR序列的 5
或 3
末端加上 2~ 4 个随
机选择的核苷酸作为引物,以位于反向排列于 SSR
之间的 DNA 序列为基础进行的 PCR扩增, 具有同
SSR一样丰富的多态性, 且重复性好、操作简便、成
本低, ISSR标记技术在植物种群遗传学、种质资源
分类学与种系发生学等方面得到了迅速而广泛的应
用[ 14, 15] ,但利用 ISSR技术对高丹草杂交种及其亲本
进行遗传关系分析尚未见研究报道。本试验拟利用
ISSR分子标记技术对散穗高粱与 4种苏丹草杂种 F1
及其亲本的 DNA 多态性位点进行分析,以期从 DNA
水平明确其遗传差异性程度,为其后代分子标记辅助
选育及杂种优势的评价和利用提供依据。
1
材料与方法
1. 1
材料
供试材料为亲本散穂高粱、黑壳苏丹草、白壳苏
丹草、棕壳苏丹草、红壳苏丹草及散穂高粱
黑壳苏
丹草 F 1、散穂高粱
白壳苏丹草 F1、散穂高粱
棕
壳苏丹草 F1、散穂高粱
红壳苏丹草 F 1。试验于
2009年 5- 7月在室内进行。
1. 2
研究方法
1. 2. 1
DNA 提取与检测
剪取各供试材料的幼嫩
叶片,用植物基因组试剂盒(购自北京天根生化科技
有限公司)提取 DNA(每材料随机取 20个单株的叶
片混合) , 用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯
度[ 1 6] ,将各材料的 DNA 浓度稀释至50 ng/
L 置冰
箱中保存备用。
1. 2. 2
ISSR
PCR分析
1. 2. 2. 1
扩增反应体系: 10
Buf fer(不含 Mg 2+ ) ,
2 mmol/ LM g
2+
, 0. 2 mmol/ LdNTPs, T aq DNA 聚
合酶 0. 04 U ,引物 0. 4
mol/ L,模板 1. 0 ng/
L。
1. 2. 2. 2
扩增反应程序: 94
变性 4 m in, 1 个循
环; 94
变性 30 s, 50
退火 45 s, 72
延伸 2 min,
45个循环; 72
延伸 10 min, 1个循环后终止反应。
PCR仪为 Biometra Tg radient 96。
1. 2. 2. 3
琼脂糖凝胶电泳检测:取 5
L 预扩增产
物,在 1. 5%琼脂糖凝胶中进行电泳, 电压为 50 V,
电泳时间 2 h。凝胶用核酸染料进行染色,并照相。
1. 2. 2. 4
引物筛选:以母本散穗高粱和父本 4种苏
丹草的基因组 DNA 为模板,进行 ISSR适宜引物筛
选。从 150个引物中筛选出条带清晰、稳定性好、多
态性丰富的适宜引物 14个,其引物及其碱基序列见
表 1。
表 1
ISSR分析所用的引物及其碱基序列
Table 1
P rimer s and their nucleotide sequences used in ISSR analysis
引物
Primer
序列
S equence
引物
Prim er
序列
Sequence
62413 5

GAG AGA GAG AGA GAG AAC
3
75511 5

ACA CAC ACA CAC ACA CYG
3

67771 5

AGA GAG AGA GAG AGA GCT A
3
75515 5

T GT GT G T GT GTG TGT GRA
3

67772 5

GAG AGA GAG AGA GAG ACT T
3
62411 5

CCC GTG T GT GTG TGT
3

62408 5

T GT GTG TGT GT G TGT GG
3
75522 5

GAG AGA GAG AGA GAG AT T A
3

81409 5

GT G T GT GT G T GT GTG TGT A
3
67769 5

ACA CAC ACA CAC ACA CT
3

75508 5

GGA GAG GAG AGG AGA
3
67775 5

CT C T CT CT C TCT CTC T AG G
3

75509 5

T GT GTG TGT GT G TGT GRC
3
67768 5

CT C CT C CTC CT C CT C CTC
3



注:接头和引物由上海生工生物有限公司合成
Note: T he adapters an d prim ers w ere synthesized by Sh angh ai Sangon Biological Engineering Co. Ltd
1. 3
ISSR标记的数据处理
记录胶板上清晰的条带,按照点样顺序逐条对多
态性带进行比对,在有差异谱带的位置进行记录,
有
带
记作
1
,
无带
记作
0
,生成
0
、
1
组成的数
矩阵,对没有多态性的位点,只记录每个引物扩增的
相同位点条带总数。计算下列相关遗传系数[ 17] :
1. 3. 1
多态性条带百分率( Percentage of po lymo r

phic bands,简称 P) : P= ( K/ N)
100% ,其中 K 为
扩增出的多态条带数目, N 为扩增出的条带总数。
1. 3. 2
计算供试材料的遗传相似系数和遗传距离,
遗传相似系数 GS= 2Nij/ ( Ni+ Nj) , 其中 Nij是指
材料 i和材料 j共有的片段数目, Ni+ N j指在 2个
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材料中出现的片段数目之和。遗传距离 GD= 1-
GS。根据类平均聚类方法( U PGMA ) , 运用 DPS
V8. 01分析软件进行聚类[ 18]。
2
结果与分析
2. 1
供试材料的 DNA质量检测
用植物 DNA 试剂盒提取 9个供试材料基因组
DNA的电泳条带清晰、均匀,无拖尾现象,说明所提取的
DNA纯度很高,完全能满足 ISSR分析的要求(图1)。
图 1
9 个供试材料的基因组 DNA电泳检测
Fig . 1
Genomic DNA electr opho resis of 9 tested plants
1.
散穗高粱; 2.
黑壳苏丹草; 3.
白壳苏丹草; 4.
棕壳苏
丹草; 5.
红壳苏丹草; 6. 散穗高粱
黑壳苏丹草 F1 ; 7. 散穗高粱

白壳苏丹草 F1 ; 8.散穗高粱
棕壳苏丹草 F1; 9. 散穗高粱
红
壳苏丹草 F1
1.
Sorghum; 2.
Black hu ll sudangrass; 3.
White hu ll
sudangras s; 4.
Brow n hul l sudangrass; 5.
Red hul l sudan

grass ; 6. Sorghum
black hull sudangrass; 7. Sorghum
w h ite hu ll
sudangras s; 8. S orghum
br ow n hull sudangrass; 9. Sorghum
red
hull sudangrass
2. 2
ISSR扩增结果
利用筛选出的 14 个 ISSR 适宜引物对 9 个供
试材料进行 PCR扩增,其多态性统计结果如表 2所
示。14个引物共扩增出 451条带, DNA 片段长度
在 200~ 2000 bp 之间,平均每个引物扩增出 32. 21
条,其中 416条具有多态性, 多态性条带百分率为
92. 2%,表明 9 个供试材料的 ISSR 多态性丰富。
在这 14个引物中,以引物 67772 扩增的条带最多,
为 53条; 引物 62413扩增的条带最少, 为 12条。各
供试材料的 ISSR指纹图谱存在明显差异(图 2) , 每
个引物都可以清晰地将供试亲本及杂种 F 1 区别开
来,这为杂种真实性鉴定提供了分子依据。
2. 3
遗传距离和聚类分析
由表 3可知, 9个供试材料间的遗传距离( GD)
变幅较大,在 0. 1818~ 0. 7838之间,平均为0. 6892;
亲本之间,母本散穗高粱与 4 个父本苏丹草间的遗
传距离大小顺次为:红壳丹草( GD值 0. 7368) > 黑
壳苏丹草 ( GD 值 0. 4118) > 棕壳苏丹草 ( GD 值
0. 3226) > 白壳苏丹草( GD值 0. 2647) ,该研究结果
可为亲本杂交组合的选配及后代杂种优势的评价提
供分子依据。
表 2
9 个供试材料 ISSR 引物及其扩增结果
Table 2
P rimer s used in ISSR and am plification
r esults of 9 t ested plants
引物
Prim er
扩增条带数
No. of amplif ied
bands
多态性条带数
No. of polymorphic
ban ds
多态性条带百分率(% )
Percentage of
polymorphic bands

62413 12 10 83. 3

67771 17 15 88. 2

67772 53 53 100. 0

62408 43 39 90. 6

81409 41 37 90. 2

75508 17 16 94. 1

75509 28 28 100. 0

75511 35 28 80. 0

75515 51 51 100. 0

62411 36 27 75. 0

75522 13 11 84. 6

67769 50 46 92. 0

67775 16 16 100. 0

67768 39 39 100. 0
合计 Total 451 416 92. 2


以 GD值 0. 44为基准, 9个材料聚为 3 类: 第
一类为散穗高粱、棕壳苏丹草、黑壳苏丹草、白壳苏
丹草;第二类为散穗高粱
黑壳苏丹草 F1、散穗高
粱
白壳苏丹草 F1、散穗高粱
红壳苏丹草 F1、散
穗高粱
棕壳苏丹草 F1 ; 红壳苏丹草单独为一类
(图 3)。表明 4 个杂种 F1 与其双亲间存在着明显
的遗传差异,这从 DNA 分子水平进一步验证了杂
种 F 1 的真实性。
3
讨论
ISSR分子标记通常为显性标记,呈孟德尔式遗
传。ISSR 技术具有 DNA 用量少、引物设计容易、
实验成本低廉、操作过程简单、多态性丰富、重复性
较好等优点,已被应用于作物遗传多样性分析、品质
鉴定、辅助育种、遗传图谱构建等研究[ 19]。但在牧
草上应用较少, 特别利用 ISSR 技术对高粱与苏丹
草杂交种进行遗传分析尚未见有研究报道。在本试
验的 PCR扩增及引物筛选过程中体会到,在所有因
素中退火温度、Mg2+ 浓度及引物浓度对扩增效果影
响较大。试验结果表明, 退火温度低于 50
时, 同
一引物会出现条带弥散或无带现象; 当温度高于
5 0
时则出现非特异性扩增带;当退火温度设定为
720
第 6期 周亚星等:散穗高粱与苏丹草杂种的 ISSR 分析
表 3
供试材料的遗传距离矩阵
Table 3
Genet ic distance matrix o f tested plants
No. 1 2 3 4 5 6 7 8
2 0. 4118
3 0. 2647 0. 1818
4 0. 3226 0. 5000 0. 3667
5 0. 7368 0. 7838 0. 6486 0. 7353
6 0. 5161 0. 6667 0. 6000 0. 4444 0. 7353
7 0. 4706 0. 5455 0. 4848 0. 5333 0. 6216 0. 3000
8 0. 5172 0. 7143 0. 6786 0. 6000 0. 6563 0. 3600 0. 4643
9 0. 4154 0. 5556 0. 5238 0. 3684 0. 7746 0. 3684 0. 2698 0. 4717


注: 1.
散穗高粱; 2.
黑壳苏丹草; 3.
白壳苏丹草; 4.
棕壳
苏丹草; 5.
红壳苏丹草; 6. 散穗高粱
黑壳苏丹草 F1 ; 7.散穗高
粱
白壳苏丹草 F1; 8.散穗高粱
棕壳苏丹草 F1; 9. 散穗高粱

红壳苏丹草 F1
Note: 1.
Sorghum ; 2.
Black hull su dangrass ; 3.
White
hull sudangrass; 4.
Brow n hull sudangrass; 5.
Red hull sudan

grass ; 6. Sorghum
black hul l sudangrass F1; 7. S org hum
w hite
hull s udang rass F1 ; 8. S orghum
brow n hull sudangrass F1; 9.
S orghum
r ed hull su dangrass F1
50
时对高粱与苏丹草杂交种扩增效果最好。试验
中 Mg2+ 浓度低于 2 mmo l/ L 时, ISSR条带不清晰,
M g
2+ 浓度高于 2 mmol/ L 时, 有条带缺失现象, 故
确定适宜的 Mg2+ 浓度为 2 mmol/ L。当引物浓度
低于 0. 4
mo l/ L 时,无扩增产物或谱带不全,浓度
高于 0. 4
mo l/ L 时,扩增产物主带减弱, 并出现非
特异性条带, 本试验确定适宜引物浓度为 0. 4

mo l/ L。可见,筛选适宜的 ISSR
PCR反应体系是
得到理想试验结果的关键。
植物杂种优势的产生在一定程度上取决于亲本
之间的遗传差异, 遗传差异大说明其亲缘关系较远,
其杂交后代的杂种优势较大[ 20, 21]。植物表型性状
是基因表达的结果, 但表型性状因受环境条件的影
响,仅从表型上有时难以判断亲本间遗传差异的大
小,并难以预测其后代杂种优势的强弱。从 DNA
721
草
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分子水平上,查明亲本及其杂种间的遗传差异大小,
对选配亲本杂交组合及其杂种优势利用评价有重要
的理论指导价值。本试验利用 ISSR 分子标记技术
首次对散穗高粱与 4个苏丹草亲本间的遗传距离
( GD)分析结果表明,母本散穗高粱与 4个父本苏丹
草之间的遗传距离不同,与红壳苏丹草的 GD 值最
大,其次为黑壳苏丹草, 再次为棕壳苏丹草, 与白壳
苏丹草间的 GD 值最小。理论上, 在散穗高粱与 4
个苏丹草杂交组合中, 以散穗高粱与红壳苏丹草杂
交种的杂种优势最强, 而散穗高粱与白壳苏丹草杂
交种的杂种优势相对较弱, 但这 4个杂交种在田间
的杂种优势表现如何,尚需进一步实验验证。
4
结论
利用 14 个 ISSR 适宜引物对 9个供试材料扩
增得到 451条带, DNA 片段长度变幅为 200~ 2000
bp,平均每个引物扩增出 32. 21条,多态性条带 416
条,多态性条带百分率高达 92. 2%。各供试材料的
ISSR指纹图谱存在明显差异, 可作为亲本及杂种
F1 鉴定的遗传标记。
9个供试材料间的遗传距离 ( GD) 变动在
0. 1818~ 0. 7838之间,平均为 0. 6892。以 GD 值
0. 44为基准,可将 9个材料分为 3类:散穗高粱、棕
壳苏丹草、黑壳苏丹草、白壳苏丹草为一类, 散穗高
粱
黑壳苏丹草 F1、散穗高粱
白壳苏丹草 F 1、散
穗高粱
红壳苏丹草 F 1、散穗高粱
棕壳苏丹草F 1
为另一类, 红壳苏丹草单独为一类。散穗高粱与红
壳苏丹草的亲缘关系较远, 而与白壳苏丹草亲缘关
系较近。
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才
杰)
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