全 文 ：第 15 卷 第 4 期
Vol. 15 No. 4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2007 年 7 月
Jul. 2007
文章编号: 10070435( 2007) 04034404
采用微卫星( SSR)标记研究苜蓿品种鉴定初报
王小山1, 3 , 陈志宏2* , 韩建国3, 王志刚2
( 1.扬州大学动物科技学院, 扬州 225009;
2. 农业部全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存利用中心, 北京 100094; 3.中国农业大学草地研究所, 北京 100094)
摘要: 苜蓿( Medicago sativa L . )是异花授粉植物, 自交则衰退,品种内个体间基因型杂合,因此品种鉴定的难度较
大。本文以苜蓿地方品种、育成品种和引进品种为材料, 采用微卫星分子标记研究和鉴定供试苜蓿品种。结果表
明:采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 PCR产物分离可以避免非特异带的出现, 降低了实验误差; 在品种鉴定方
面, AFca1 位点片段大小为 148 bp 的等位基因在龙牧系列品种中出现的频率明显高于其它品种 ,可作为品种区别
的依据;在其它品种之间或与杂花苜蓿品种之间, 多数的 SSR位点有基本相同的基因型和等位基因,品种间的区别
主要在于等位基因频率的差异,而大部分品种之间频率的差异很小,不能作为鉴定的依据, 即仅靠有限的 SSR位点
很难区别供试苜蓿品种;通过某些品种特有性状相连锁的分子标记与其它品种之间的差异作为鉴定的依据进行探
索研究,或许能真正将某些苜蓿品种与其它品种区别开。
关键词: 苜蓿; SSR ; 品种; 鉴定
中图分类号: S812; Q943 文献标识码: A
A Preliminary Study on Alfalfa Cultivar Identif ication Using SSR Markers
WANG Xiaoshan1, 3 , CHEN Zhihong 2* , HAN Jianguo3 , WANG Zhigang2
( 1. College of An imal S cien ce an d T echnology, Yangzhou U nivers ity, Yangzhou, Jiangsu Province 225009, China;
2. Preservat ion and Ut ilizat ion C enter of Domes tic An imals and Forage Germplasm Resou rces , Nat ional Anim al
H usbandry an d Veterinary Ser vice, M inist ry of Agriculture, Beijing 100094, China;
3. Inst itute of Gras sland Science, China Agricu ltural U nivers ity, Beij ing 100094, China)
Abstract: Being as a plant of crosspo llinat ion, the cult ivar ident if ication of alfalfa (Medicago sat iva L. ) is
more diff icult than other selfpo llinat ion plant because o f the adm ixture genotypes w ithin a cult ivar. A pre
l im inary study on alfalfa cult ivar ident if icat ion w as conducted on nat iv e cultiv ars, bred cult ivars, and cr oss
cult iv ar s using SSR markers. T he results suggest that some nonspecif ic bands w er e avo ided by using dena
tured gels fo r the separ at ing o f PCR products; the gene f requency of 148bp band of AFcal loci was much
higher in Longmu ser ies cult ivars than that in other alfalfa cult ivars, by w hich Longmu cult ivars w ere i
dent ified among alfalfa cult ivars. How ever, the gene frequency dif ferences could not be used fo r other cul
t ivar ident if ication, because the differences among other alfalfa cult ivars w ere small. T hus, it w as ver y dif
f icult to ident ify all alfalfa cult ivars by using lim ited SSR markers. Some alfalfa cult iv ar s could be ident i
f ied by using the mo lecular marker associated w ith a specific t rait of the cult iv ar .
Key words: Alfalfa ( Med icago sativa L. ) ; SSR; Cult ivars; Ident if icat ion
1998年我国全国牧草品种审定委员会审定并
登记了 35个苜蓿品种,其中育成品种 16个, 地方品
种 18个, 引进品种 1个[ 1] ; 1999- 2003年又有 4 个
育成品种、2个地方品种、4个引进品种通过审定; 到
2002年全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存
利用中心共入库保存了 240份引进的苜蓿品种, 这
些材料来自美国、加拿大、澳大利亚、丹麦、日本、罗
马尼亚、捷克、英国、俄罗斯、德国、匈牙利、印度等
12个国家。可见苜蓿新品种的选育推广, 种质创新
与利用受到各国的重视。
收稿日期: 20070115; 修回日期: 20070619
作者简介: 王小山( 1974) ,河北承德人,博士研究生,研究方向为牧草育种与生物技术; * 通讯作者 Author for correspondence, Em ail
zhchen 0209@ sina. com
第 4期 王小山等:采用微卫星( SSR)标记研究苜蓿品种鉴定初报
随着品种数量的增加,品种及种质的产权问题、
种子质量问题越来越严重。苜蓿品种鉴定的作用
是:确定其种子的真实性和纯度, 对种子进行分级;
辅助苜蓿新品种审定登记和产权保护; 研究苜蓿种
内和种间的遗传多样性和亲缘关系,对种质库中的
苜蓿种质资源样品进行准确鉴定和评估; 同时也对
苜蓿种质资源的有效利用具有指导作用 [ 2]。
微卫星( SSR)又称简单重复序列, 该标记能获
得高于其它标记的遗传信息量,因此,倍受遗传学家
的青睐[ 3]。Diw an 等查找了苜蓿核苷酸序列资料
库,通过筛选和测序发现苜蓿基因组中大约有 1900
个( AT ) n+ ( CT ) n+ ( CA) n+ ( A TT ) nSSRs, 这些
微卫星标记可以用于苜蓿的基因型鉴定。为了构建
完整的四倍体苜蓿遗传图谱[ 4] , Julier 等于 2003 年
公布了 232对苜蓿微卫星引物 [ 5]。在国内近年有些
关于苜蓿的 SSR和 ISSR 的报道 [ 7, 8]。这些研究为
微卫星标记在苜蓿上的应用带来了很大方便。
在不同水平上鉴定的植物品种研究报导已经很
多[ 8~ 15]。但是,苜蓿是同源四倍体, 异花受粉, 有关
遗传研究进程缓慢。与二倍体、自花受粉和营养繁
殖的植物相比四倍体苜蓿的品种鉴定有一定困难,
有关采用 DNA 指纹技术进行苜蓿品种鉴定的报导
较少,本试验拟采用 SSR 技术对国产及引进的 8个
苜蓿品种进行初步鉴定, 为苜蓿品种识别提供参考。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
地方品种 新疆大叶苜蓿( Medicago sativa L.
cv. Xinjiang Daye)、肇东苜蓿(Medicago sativa L. cv.
Zhaodong)、无棣苜蓿(Medicago sativa L. cv. Wudi)。
育成品种 甘农 1 号(Medicago varia M. cv.
Gannong No. 1)、龙牧 801 (Meli lotoides ruthenicus L.
Sojak Medicago sativa L. cv. Longmu 801)、龙牧
803 (Melilotoides ruthenicus L. Sojak Medicago sa
tiva L. cv. Longmu 803)。
引进品种 皇后( Medicago sativa L. cv. Al
faQueen)、阿尔冈金(Medicago sativa L. cv. Algon
guin)。
1. 2 DNA提取
实验室盆栽育苗,当单株达到 10片真叶时, 从
每个品种中随机抽取 50个单株,每株分别取 4片叶
放入 1. 5 mL 的离心管内, 用液氮冷冻后研磨成粉
末,加 500 mL CT AB裂解液65 水浴30 min, 用氯
仿异戊醇抽提 3次后乙醇沉淀 2 次, 烘干后加入
T E溶解。用紫外分光光度仪测定 DNA 浓度,于-
20 冰箱保存。
1. 3 微卫星引物及 PCR
PCR反应条件为 95 5 min ( 94 30 s, 55
45 s, 72 90 s) 35个循环, 72 10 min。
1. 4 凝胶电泳
将 PCR产物经琼脂糖电泳,鉴定为阳性后分别
在变性( 6% )与非变性聚丙烯酰胺凝胶( 8%)上进行
电泳。其中变性电泳的样品为 75%变性上样缓冲
液( 95%甲酰胺、10 mmol EDT A、pH 8. 0、0. 09%二
甲苯蓝、0. 09%溴酚蓝) , 25% PCR 产物, 95 变性
5 min后迅速置于冰上冷却。非变性胶的样品是
75%上样缓冲液 ( 40% 蔗糖、0. 15% 二甲苯蓝、0.
15%溴酚蓝) , 25% PCR 产物。上样量均为 8 L,
电压 150 V, 1 TBE电泳 16~ 20 h。
表 1 实验选用引物及引物序列信息
T able 1 Sequences and sequence information o f SSR ( micr osatellite) for a lfalfa PCR primer pairs
位点
L ocus
核心序列
Core m ot if
5正链
5End primer ( sen se)
3反链
3End prim er ( ant is ens e)
片段大小
Alleles range
等位基因数
Alleles number
AFca1 ( C T) 4( CA) 10 cgtatcaatatcgggcag tgt tatcagagagagaaagcg 112171 7
AFca11 ( CA)11 ct tgagggaactat tgt tgagt aacgtt t cccaaaacatact t 136160 6
M TR58 gaagtggaaatgggaaacc gagtgagtgagtgtaagagtgc 4
AFct45 ( C T) 8AT ( CT) 3 taaaaaacggaaagagt tggt tag gccatct t t t ct t tt gcttc 123145 5
AFctt1 ( C TT ) 9( CAA) 3 cccatcatcaacat t t t ca t tgtggat tggaacgagt 99126 10
M TLEC2A ( AT) 19 cggaaagat tct tgaatagatg tggt tcgctgt tctcatg 181191 4
1. 5 银染
取出电泳后的凝胶, 做好标记后用蒸馏水洗涤
1次,加入 25%的乙醇固定 3 m in,回收乙醇,用 1%
的硝酸氧化 3 min, 0. 2%硝酸银染色 15~ 30 m in,
显色液( 0. 2%甲醛、3% Na2CO 3 )显色至条带清晰,
以 10%乙酸终止显色。其间每一步在弃去各种液
体后,用蒸馏水洗涤 1~ 2次,每次 1~ 2 m in。
2 结果与分析
2. 1 变性和非变性胶电泳结果比较
Afct t1PCR扩增产物在变性 PAGE 凝胶和非
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草 地 学 报 第 15卷
变性 PAGE 电泳后均能分离出所需目的片段, 但是
从图 1、2中可以看出, 同一个体的基因型结果在 2
种胶上有明显的区别,例如, 1号和 8号个体在变性
胶上分别有 3条和 4 条带出现, 而在非变性胶上则
有 5条带出现。另外, 在变性胶上出现同一个等位
基因片段的两条 DNA 链分离现象(图 3)。
图 1 Afctt1PCR扩增产物在变性 PAGE凝胶上的
电泳结果(龙牧 801)
Fig. 1 PCR productions o f Afctt1 on denatured
PAGE gel ( the experimental materia ls
wer e alfalfa cultiva r Longmu 801)
图 2 Afctt1PCR 扩增产物在非变性 PAGE凝胶上的
电泳结果(龙牧 801)
Fig . 2 PCR productions of A fctt1 on nondenat ur ed
PAGE gel ( the experimental materia ls
wer e alfalfa cultiva r Longmu 801)
图 3 AFca11 PCR扩增产物在变性 PAGE凝胶上的
电泳结果(龙牧 801)
F ig . 3 PCR productions of A fca11 on nondenatur ed
PAGE gel ( the experimental materia ls
wer e alfalfa cultiva r Longmu 801)
2. 2 苜蓿 SSR扩增图谱
6 对引物 AFca1、AFca11、MTR58、AFct45、
AFctt1和 MTLEC2A 在本实验所选用的苜蓿材料
中均能扩增出理想的谱带, 每个个体最多只有 4 条
谱带。同一材料不同个体之间基因型差异较大, 不
同材料之间的基因型差异较小。供试材料在 6个检
测的位点均有相同的主效等位基因, 不同材料之间
特有等位基因较少, 而且出现的频率较低。165 bp
的等位基因是供试材料在 A Fca1 位点的主效等位
基因,该等位基因在引进品种阿尔冈金和皇后出现
的频率最高,均大于 90% , 而其它等位基因出现的
频率较低; 165 bp的主效等位基因在杂花苜蓿品种
甘农一号中出现的频率最低,而其它等位基因出现
的频率较高。148 bp 的等位基因在龙牧 801 和龙
牧 803出现的频率最高( > 64% ) , 在阿尔冈金、皇
后、新疆大叶、肇东和甘农 1号苜蓿等出现的频率分
别为 15%、16%、24%、28%和 12%(图 4)。
图 4 阿尔冈金(A)、皇后( B)、无棣苜蓿( C)、龙苜 801(D)
和甘农 1 号(E)品种在 AFca1 位点上的 PCR 扩增产物
在变性 PAGE凝胶上的电泳结果
F ig . 4 PCR product ions of A fca1 on nondenatured
PAGE gel in alfalfa cultivars o f A lg onguin ( A ) ,
A lfaQueen ( B) , Wudi( C) , L ongmu 801 ( D) ,
and Gannong No. 1( E)
3 讨 论
3. 1 SSR 是广泛应用的一种分子标记, 主要应用
于分子生态、系统发育与进化研究,在分子标记辅助
育种的实践中也显示出巨大的潜力[ 3]。银染聚丙烯
酰胺凝胶法在许多实验室用来检测微卫星 PCR扩
增产物。本实验以苜蓿为材料, 利用变性与非变性
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第 4期 王小山等:采用微卫星( SSR)标记研究苜蓿品种鉴定初报
聚丙烯酰胺凝胶对微卫星产物进行电泳分析时发
现,二者对微卫星 PCR产物的电泳结果有较大的差
别,在非变性凝胶中出现大量的非特异性条带极大
地影响了分析带形的准确性。产生非特异性条带的
原因可能是:在非变性胶中,由于非特异性条带、特
异性条带,以及杂合子的等位基因之间在复性时, 可
能形成杂合双链,而导致杂合链上有突环形成,从而
使其在电泳过程中速度大大降低。因此在非变性胶
中有较多的非特异条带的出现。而在变性胶电泳
中, DNA以单链形式存在,并且不形成二级结构, 因
此这种条带能反映真实的微卫星扩增结果 [ 16]。在
扩增结果中发现苜蓿的 SSR特异条带最多会出现 4
条, 同时, 在某些位点不同个体间的变异较大。因
此,为了减少苜蓿 SSR标记结果中非特异带造成的
误差,推荐使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测微
卫星 PCR扩增产物。
3. 2 由于在变性胶中 PCR产物是单链并且不受其
碱基组成的影响, 因此, 如果微卫星 PCR 产物的 2
条互补链分子质量相近(图 1) , 在变性胶中 1 个等
位基因表现为单带, 杂合子为双带;如果 PCR 产物
的 2条互补链分子质量相差较大(图 3) , 在变性胶
中一个等位基因表现为双带, 出现了双链分离现象。
3. 3 由于 SSR 是一种共显性标记, 苜蓿及其杂交
品种均为同源四倍体, 在本实验的苜蓿个体中有完
全杂合、不完全杂合和纯合 3类基因型, 因此, 在电
泳图谱上相应出现 4 条带(完全杂合)、2 条或 3 条
带(不完全杂合)和 1条带(纯合)等 4 类表现型(图
4)。通过对图谱观察分析可知, 同一材料的不同个
体间变异较大, 而且基因型以杂合为主,不同材料间
的基因型类型差异较小, 供试材料在 6个检测的位
点均有相同的主效等位基因, 不同材料间特有等位
基因较少, 而且出现的频率较低。该结果与苜蓿为
异花授粉植物, 自交衰退的结论相一致。
3. 4 采用 SSR 标记进行品种鉴定主要通过基因频
率、基因型频率和特有等位基因实现。由于苜蓿具
有异花授粉,自交衰退的繁殖特点,因此品种间变异
较小,同时也为苜蓿品种鉴定带来困难。通过对 6
个位点检测结果分析发现, 本实验选择的苜蓿材料
均有相同的主效等位基因,而且在品种之间, 在紫花
苜蓿与杂花苜蓿品种之间主效等位基因和非主效等
位基因出现的频率差异不大, 不能用来作为品种鉴
定的依据。在某些品种中会出现 1个或几个特 有
等位基因,但是这些特有等位基因出现的频率较低,
能否用来作为品种鉴定的依据值得商榷。龙牧 801
和龙牧 803是苜蓿与扁蓿豆杂交后获得的品种, 由
于有远缘遗传物质的流入,因此在 AFca1位点片段大
小为 148 bp的等位基因在龙牧系列品种中出现的频
率明显高于其它品种,该等位基因可以作为龙牧品种
与其它苜蓿品种相区别的依据。
4 结 论
4. 1 采用变性聚丙烯酰胺凝胶分离 PCR扩增产物,
可以减少非特异带的出现,从而降低了实验误差。
4. 2 仅靠有限的一些 SSR位点很难区别开供试的
苜蓿品种。
4. 3 AFca1位点片段大小为 148 bp的等位基因可
以作为龙牧品种与其它苜蓿品种区别的依据。
4. 4 通过某些品种特有性状相连锁的分子标记与其
它品种之间的差异作为品种鉴定的依据进行探索研
究,或许能真正的将某些品种与其它品种区别开。
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(责任编辑 孟昭仪)
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