全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2004) 02-0098-05
加拿大披碱草-野大麦三倍体杂种加倍植株同工酶分析
马艳红,于　卓* ,赵晓杰,刘　杰
(内蒙古农业大学农学院 ,呼和浩特 010019)
摘要: 分析了加拿大披碱草-野大麦三倍体属间杂种 F1 加倍植株的同工酶酶谱特征。结果显示: 同一生育阶段杂种自然
加倍植株与加倍 F 1代植株在 EST、POD 和 SOD 酶带的数目、位点及强弱方面具有一致性和遗传稳定性, 而与杂种F 1代
及亲本的酶带表型差异显著, 从酶蛋白分子水平证明该杂种 F 1染色体加倍是真实的; 加倍植株抽穗期旗叶的 EST、POD
酶谱中分别呈现9 和 4 条酶带,分蘖期幼叶的 EST、POD、SOD酶谱内分别呈现8、4 和 4条酶带, 有多态性位点的特征酶
带可作为杂种加倍后代育性恢复鉴定的遗传标记的候选位点;对供试材料不同生育阶段做同工酶酶谱对比分析, 比单一
生育阶段更能反映其酶带表型的遗传差异性 ,提高同工酶电泳技术鉴定结果的准确性。
关键词: 草原学;多年生禾草; 属间杂种 F1 ;加倍植株; 同工酶;酶带表型
中图分类号: S 812; Q55　　　文献标识码: A
Isozyme Analysis of Chromosome-Doubling Plant of Triploid Hybrid
of Elymus Canadensis and Hordeum Brevisubulatum
MA Yan-hong , YU Zhuo
*
, ZHAO Xiao-jie, LIU Jie
( Ag ronomy co lleg e, Inner M ongo lia Agr icultur al U niver sity , Hohhot , Inner M ongo lia Aut onomous Region, 010019, China )
Abstract: The isozyme zymog rams of chromosome-doubling plant o f inter genus t riploid hybrid F1 of Elymus
canadensis and Hordeum brevisubulatum were analyzed with discont inuous polyacrylam ide gel electr ophor esis
method. T he results show that the natural chromosome doubling-plant of t riploid hybrid F1 and the chromo-
some-doubling F1 exhibited uniformity and genet ic stability in number, locus and intensity of esterase ( EST ) ,
pr oxidase ( POD) and super oxide dismutase ( SOD) isozyme bands at the same grow th-development stage, but
they w ere signif icant ly dif ferent fr om the hybr id F 1 and their parents in isozyme band characters, w hich pro ved
that the chromosome doubling plant of t riploid hybrid F1 was genuine in pro tein level. The Chromosome-dou-
bling plant had 9 and 4 bands in iso zyme zymograms o f EST and POD respectively at ear ing stage, and had 8,
4 and 4 bands in isozyme zymogr ams o f EST , POD and SOD r espect ively at t illering stage, the polymorphic
isozyme bands can be used as genet ic marker s to ident ify the fert ility r ecovering of chromosome doubling plant
of hybrid. To analyze and compar e iso zyme zymog rams o f tested plant at dif ferent developing stages can also
reflect the genet ic dif ferences mo re cor rect ly to enhance the accuracy o f ident ified result by isozyme elec-
tr ophor esis than at only one gr ow th stage.
Key words: Grassland science; Perennial g rasses; Interg enus hybrid F1 ; Chr omosome doubling plant ;
Isozyme; Isozyme band phenotype
　　加拿大披碱草-野大麦属间杂交种 F1 代, 是利用
产于内蒙古草原的分蘖性和耐盐性强的四倍体多年生
野生草种-野大麦( H ordeum brevisubutum Link. 2n=
4x= 28,染色体组 H1H1H2H 2)与引自北美洲具高产优
质特性的四倍体栽培种-加拿大披碱草 ( Elymus
canadensis L. 2n= 4x= 28,染色体组SSHCHC)相组配,
收稿日期: 2003-10-30;修回日期: 2004-03-03
基金项目:国家自然科学基金项目( 30160058)、教育部留学回国人员基金项目( 2001345)、内蒙古自然科学基金项目( 2002305)资助
作者简介:马艳红( 1980-) ,女,内蒙古赤峰市宁城县人,硕士研究生,从事饲用作物遗传育种研究,已发表学术论文 3篇; * 通讯作者 Auth or for
correspondence　E-mail: yz-yz5810@ sina. com
第 12卷　第 2期 草　地　学　报 2004年　6 月
Vo l. 12　　No. 2 ACT A AGRESTIA SIN ICA June　　　　　2004
人工授粉杂交而成 [ 1]的, 杂种优势强,但花粉败育, 开
放授粉不结实。其原因是 F1 代发生了染色体数目变
异,来自母本加拿大披碱草 HC 染色体组的 7条染色
体丢失, F1 代为三倍体( 2n= 3x= 21) ,其染色体组组
成为 SH 1H2[ 2, 3]。为了克服杂种 F 1代植株的不育性,
2 002年笔者在利用秋水仙素对该三倍体杂种加倍的
同时,在田间 F 1代分株繁殖的杂种圃中发现了一些珍
贵的高大变异株丛,经细胞学和形态学鉴定,确认为自
然加倍植株, 染色体数目为 42 条, 花粉可育率
84. 97%、结实率 77. 51%, 并将当年收获的种子于秋
季播种得到了加倍 F 1代植株。2003年 3～9月对其农
艺性状和细胞遗传学特性进行深入研究。本试验利用
同工酶电泳技术对自然加倍植株、加倍 F 1代及杂种
F 1代和其亲本在抽穗期和分蘖期的酯酶( EST )、过氧
化物酶( POD)、超氧化物歧化酶( SOD)酶谱进行比较
分析,以期从蛋白质水平揭示其遗传差异性,为加倍后
代优良株系选育利用提供理论依据。
1　材料与方法
1. 1　供试材料　加拿大披碱草(♀)×野大麦(♂)及
其杂交种 F1 代, 以及杂种 F 1代的自然加倍植株和加
倍 F 1代植株。种植在内蒙古农业大学农作物试验场。
试验场位于呼和浩特市东郊,年降水量 400 mm 左右,
无霜期 145 d, 土壤为沙壤质暗栗钙土, pH 7. 8～8. 2,
肥力适中,具有灌溉条件。试验于 2003年 3～9月在田
间和室内进行。
1. 2　研究方法
1. 2. 1　酶液提取
分别剪取抽穗期旗叶和分蘖期的幼叶,每种材料
混合取样, 蒸馏水洗净后,称量 0. 5 g , EST 和 POD 加
入 10%甘油, SOD加入 0. 05M pH 7. 8的磷酸钠缓冲
液 1. 2 ml, 冰浴研磨成匀浆, 移至 1. 5 ml离心管中,
EST、POD4000 rpm 离心 15 m in, SOD13000 rpm 冷
冻离心 20 min,上清液置冰箱中备用。
1. 2. 2　电泳
采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法, 胶板
厚度 1. 5 mm。EST 浓缩胶浓度为 4% , pH 6. 8;分离
胶 6% , pH 8. 9; 电极缓冲液为 pH 8. 7 的 T ris-甘氨
酸,每样孔进样量 20
l。POD 浓缩胶浓度为 3%, pH
6. 8; 分离胶浓度 5% , pH 7. 7;电极缓冲液为 pH 8. 3
的 T ris-甘氨酸,每样孔进样量 15
l。在 4℃冰箱中电
泳,初始电压 150 V,溴酚蓝指示剂走出浓缩胶时稳压
至 250V,电泳 6 h。
SOD 参考罗广华等的方法[ 5]。浓缩胶浓度为
2. 5%, pH 6. 7; 分离胶浓度 12% , pH 8. 9;凝胶的光化
学聚合在恒温光照培养箱内进行, 4×8W 日光下照射
15～20 min;电极缓冲液为 pH 8. 5的 Tr is-甘氨酸,样
孔进样量 30
l, 电泳浓缩胶电流 15 mA, 分离胶电流
20 mA, 电泳 3. 5 h。
1. 2. 3　染色
1. 2. 3. 1　EST　采用醋酸萘酯- 坚固蓝 RR 盐染色
法[ 4]。38℃恒温箱中染色 10～15 min, 7%醋酸溶液固
定。清水漂洗后, 测量记录迁移率 Rf 值, Rf= 酶带迁
移距离/前沿指示剂距离。用 Olympus-400万相素数
码相机在透射光下照相(下同)。
1. 2. 3. 2　POD　采用醋酸联苯胺染色法。胶板染色
时间 5～10 m in。
1. 2. 3. 3　SOD　染色程序:
将胶板放入 2. 45×10-
3M 氮蓝四唑( NBT )溶液中,黑暗染色 20 m in;
转入
2. 8×10-2M 四甲基乙二胺、2. 8×10-5M 核黄素、3. 6
×10-2M pH 7. 8磷酸钠缓冲液、1. 0×10-5M KCN 混
合液中,黑暗染色 15 min;
转入 1×10-4M EDTA、5
×10-2M pH 7. 8磷酸钠缓冲液混合液中,在光照培养
箱中照射 20～25 m in。
2　结果与分析
2. 1　EST酶谱特征
由图 1、2和表 1可知, 在同一生育期加倍植株与
加倍 F 1代的 EST 条带数、酶带位置和酶带强弱均完
全相同,但与杂种 F 1代差异显著。
在抽穗期加倍植株及加倍 F1代有 9条酶带,而杂
交种F 1代有 10条酶带。前者继承了双亲的 3条基带
( Rf 值为 0. 40、0. 60、0. 66) , 出现 6 条双亲的互补酶
带, 其中 4条来自母本加拿大披碱草( 0. 20、0. 70、0.
74、0. 88) , 2 条来自父本野大麦( 0. 56、0. 78) ; 后者继
承了双亲的 7条基带( 0. 23、0. 38、0. 40、0. 48、0. 60、0.
66、0. 76)和母本的 3条特征酶带( 0. 20、0. 70、0. 74)。
就酶带强弱看,前者的酶带相对于亲本有所加强,而后
者与母本相同。这说明加倍植株及加倍F 1代的酶谱继
承了双亲中表征活性强、含量高的酶带, 而杂种 F1 代
酶谱更多的偏向于母本。
在夏秋分蘖期加倍植株和加倍 F1 代呈现 8条酶
带,杂种 F 1呈现 9条酶带。二者都继承了双亲的 4条
基带( 0. 12、0. 44、0. 47、0. 87)和母本加拿大披碱草的
3条特征谱带( 0. 53、0. 72、0. 92)。它们的不同之处在
于,前者呈现了来自母本的 1条特征带, Rf 值为 0. 81;
后者呈现了条新生带和来自母本的 1条特征带, Rf 值
99第 2期 马艳红等:加拿大披碱草-野大麦三倍体杂种加倍植株同工酶分析
分别为 0. 41和 0. 96。而加倍后代与杂种 F1的酶带强
弱在分蘖期的差别不是很明显。
供试材料在抽穗期和夏蘖期的 EST 位点呈多态
性,从各生育期再现了加倍后代与杂种 F1代及其亲本
之间的区别与联系, 这些酶带特征可作为加倍植株的
识别和育性恢复鉴定的遗传标记。
图 1　抽穗期 EST酶谱
Fig. 1　EST zynogr ams at ear ing sta ge
图 2　分蘖期 EST酶谱
F ig . 2　EST zymograms at summer-aut um n tiller ing stag e.
1, 6, 7.♂野大麦; 2, 8.♀加拿大披碱草; 3, 9. 杂种 F1代; 4, 10. 加倍植株; 5, 11.加倍 F1 代
1, 6, 7. H. brivisu bulatum; 2, 8. E. canadensis ; 3, 9. Hybrid F1; 4, 10. C hromosome doubling plant ; 5, 11. Chromosome doubl ing F1
表 1　供试材料抽穗期和分蘖期 EST酶谱 Rf 值
T able 1　EST iso zyme zynog rams Rf of tested plant at earing and summer-autumn t illering stag e
酶带序号
Isoz yme
b and No.
♂野大麦
H . bri v isubulatum
抽穗
E arin g
分蘖
Til ler ing
♀加拿大披碱草
E . canad ensis
抽穗
Earing
分蘖
T illering
杂种 F1代
Hybrid F1
抽穗
Earin g
分蘖
Til lering
加倍植株
C hromosome-doubl ing p lan t
抽穗
Earing
分蘖
T illering
加倍F1 代
C hromosome-doubl ing F1
抽穗
E arin g
分蘖
Til ler ing
1 0. 04# 0. 09- - - - - - - - -
2 0. 13# 0. 12# 0. 13# 0. 12* - 0. 12- - 0. 12# - 0. 12#
3 0. 18# 0. 37* 0. 18# - - - - - - -
4 - - 0. 20- - 0. 20- 0. 41- 0. 20# - 0. 20# -
5 0. 23# 0. 44- 0. 23- 0. 44# 0. 23# 0. 44* - 0. 44* - 0. 44*
6 0. 38# 0. 47# 0. 38# 0. 47- 0. 38# 0. 47- - 0. 47# - 0. 47#
7 0. 40# 0. 50# 0. 40# 0. 50- 0. 40- - 0. 40- - 0. 40- -
8 0. 43- - 0. 43# 0. 53- - 0. 53- - 0. 53# - 0. 53#
9 0. 45- - 0. 45# 0. 72# - 0. 72# - 0. 72# - 0. 72#
10 0. 48- - 0. 48# 0. 81- 0. 48# - - 0. 81# - 0. 81#
11 0. 51- 0. 87# - 0. 87* - 0. 87- - 0. 87* - 0. 87-
12 0. 56# - - 0. 92- - 0. 92* 0. 56# 0. 92# 0. 56# 0. 92#
13 0. 60# - 0. 60- 0. 96# 0. 60- 0. 96# 0. 60# - 0. 60# -
14 0. 66# - 0. 66* - 0. 66* - 0. 66* - 0. 66* -
15 0. 68# - - - - - - - - -
16 - - 0. 70* - 0. 70* - 0. 70* - 0. 70* -
17 0. 72- - - - - - - - - -
18 - - 0. 74# - 0. 74# - 0. 74* - 0. 74* -
19 0. 76- - 0. 76* - 0. 76* - - - - -
20 0. 78- - - - - - 0. 78# - 0. 78# -
21 0. 81- - - - - - - - - -
22 - - 0. 88- - - - 0. 88- - 0. 88- -
总数 Totel 18 7 15 10 10 9 9 8 9 8
　　注: * 强带, - 中强带, # 弱带,下表同。Note: * Den se band, - Medium band , # T hin band
2. 2　POD酶谱特征
供试植物 POD 酶谱特征(酶带的位置、多少和强
弱)如图 3、4和表 2 所示。依据酶带相对迁移率 ( Rf
值)大小和集中程度, 供试材料在抽穗期和分蘖期的
100 草　地　学　报 第 12卷
POD酶谱可明显地分成 A、B 2个区。
在抽穗期,加倍植株与加倍株 F 1代的 POD 酶谱
完全一致, 均呈现 A 1、A 2、B1、B2 ( Rf 值 0. 08、0. 11、0.
58、0. 65) 4条酶带, 继承了母本的 B1 和 B22条特征
带,体现加倍后代 POD酶谱具有遗传稳定性;杂种 F 1
呈现 A 1、A 2、A 4( 0. 08、0. 11、0. 16) 3条酶带, 继承了母
本的 1条特征带 A4; 它们都具有双亲的 A 1、A 2 2条基
带。说明加倍植株和加倍F 1代继承了母本的大部分酶
带表型, 但就酶带强弱而言, 它们在 A 区再现了父本
野大麦的 A 1、A 2 2 条弱带, B区再现了母本加拿大披
碱草的 B1、B2 2条中强带; 而杂种 F 1代只表现了母本
的 A 1、A 2、A 4 3条强带。
在分蘖期,加倍植株和加倍 F 1代的 POD 酶谱均
呈现 A 2、A 5、B1、B2 ( 0. 11, 0. 18, 0. 63, 0. 69) 4 条酶带,
丢失了母本的 1 条基带 A 3 ( 0. 63) , 在酶带强弱上除
A 5外均显著增强,尤其是 B 区的 B1、B2 表现为强带;
杂种F 1代呈现 A 2、A 3、A 5、B1、B2( 0. 11、0. 13、0. 18、0.
63、0. 69) 5 条酶带, 在酶带表型上与母本加拿大披碱
草基本一致。
上述结果表明, 各材料在不同生长生育时期 POD
酶带表型有明显差异。就穗期和分蘖期比较而言,加倍
植株及加倍 F 1代的酶谱特征与杂种 F 1代存在较大差
别,特别是 B 区呈现了母本的 B1、B2 2条酶带且酶活
性增强,这些酶带特征可能与加倍后代对亲本育性性
状继承有关。
图 3　抽穗期 POD酶谱
Fig . 3　POD zynogr ams at
earing stag e
图 4　分蘖期 POD 酶谱
F ig . 4　POD zymograms at
summer-autumn tillering stag e
图 5　分蘖期 SOD酶谱
Fig . 5　SOD zynog rams at
summer-autumn tillering stage
1. ♂野大麦; 2. ♀加拿大披碱草; 3. 杂种 F1 代; 4. 加倍植株; 5. 加倍F1 代
1. H. brivisub ulatum; 2. E. canadensis ; 3. Hybrid F1; 4. Chr om osome doubl ing plant ; 5. Ch romosome doub ling F1
表 2　供试材料抽穗期和分蘖期 POD酶谱 Rf 值
Table 2　POD iso zyme zynog rams R f of tested plant at earing and summer-autumn tiller ing st age
酶带序号
Isoz yme
b and No.
♂野大麦
H . bri v isubulatum
抽穗
E arin g
分蘖
Til ler ing
♀加拿大披碱草
E . canad ensis
抽穗
Earing
分蘖
T illering
杂种 F1代
Hybrid F1
抽穗
Earin g
分蘖
Til lering
加倍植株
C hromosome-doubl ing p lan t
抽穗
Earing
分蘖
T illering
加倍F1 代
C hromosome-doubl ing F1
抽穗
E arin g
分蘖
Til ler ing
A 区 1 0. 08# 0. 08# 0. 08* - 0. 08* - 0. 08# - 0. 08# -
A region 2 0. 11# - 0. 11* 0. 11# 0. 11* 0. 11# 0. 11# 0. 11- 0. 11# 0. 11-
3 0. 13- 0. 13* - 0. 13* - 0. 13* - - - -
4 - 0. 16* 0. 16* - 0. 16* - - - - -
5 - - - 0. 18* - 0. 18* - 0. 18# - 0. 18#
B区 1 - - 0. 58- 0. 63# - 0. 63# 0. 58- 0. 63* 0. 58- 0. 63*
B region 2 - - 0. 65- 0. 69# - 0. 69# 0. 65- 0. 69* 0. 65- 0. 69*
总数 T otel 3 3 5 5 3 5 4 4 4 4
2. 3　SOD酶谱特征
夏秋分蘖期加倍植株与加倍 F 1代 SOD 酶带数、
酶带位置和酶带强弱完全一致, 而与杂种 F 1代存在一
定差异(图 5、表 3)。前者呈现4条酶带,后者呈现 2条
酶带,前者比后者多出 2条双亲互补的酶带, 1条来自
父本野大麦, Rf 值为 0. 33, 1条来自母本加拿大披碱
草, Rf值为0. 30。就酶带的相对强弱看,二者都具有亲
本活性很强的 1条基带( 0. 46) ,但其余酶带表现为不
101第 2期 马艳红等:加拿大披碱草-野大麦三倍体杂种加倍植株同工酶分析
同的弱带或中强带,加倍后代的 SOD 酶带比杂种 F 1
代强。说明加倍植株继承了双亲酶谱中活性强、含量高
的酶带,而杂种酶带表型偏向其母本。SOD 酶谱特征
亦可作为加倍后代识别和育性恢复鉴定的遗传标记。
表 3　供试材料分蘖期 SOD 酶谱 Rf 值
T able 3　SOD iso zyme zynog r ams Rf of t est ed plant a t summer-autumn tillering stag e
牧草名称 Name of grass es
酶带序号 Isoz yme band No.
1 2 3 4 5
♂野大麦 H . briv isubulatum - - - 0. 33- 0. 46*
♀加拿大披碱草 E . canad ensis 0. 17# 0. 26* 0. 30- - 0. 46*
杂种 F1 代 Hybrid F1 - 0. 26# - - 0. 46*
加倍植株 Chr omosome d oubling p lant - 0. 26- 0. 30- 0. 33- 0. 46*
加倍 F1 代 Chr om osome doubl ing F1 - 0. 26- 0. 30- 0. 33- 0. 46*
3　结论与讨论
3. 1　试验结果表明, 加拿大披碱草- 野大麦杂交种
F 1代的自然加倍植株和其加倍 F 1代在同一发育阶段
(抽穗期或分蘖期)的 EST、POD 和SOD酶谱表征(酶
带的数目、位点及强弱)具有一致性, 从酶蛋白分子水
平证明加倍后代间在遗传上是相对稳定的,这对加倍
后代的高效选择利用有一定理论指导价值。
3. 2　同工酶是基因表达的直接产物,同工酶带谱的差
异可反映基因的差异[ 6, 7, 8]。本研究加倍后代与杂种 F 1
及亲本的EST、POD和 SOD酶谱表型在抽穗期、分蘖
期 2个不同发育阶段都存在着明显的差异,从而验证
了该加倍植株及加倍 F1 代的真实性,同工酶电泳技术
用于牧草染色体加倍植株鉴定是可行的。
3. 3　同工酶酶谱表型在植物不同的发育阶段表现不
同[ 9, 10] , 本试验对 5种供试材料从几个不同的发育阶
段进行 EST、POD、SOD酶谱的对比分析, 所获得的酶
带遗传信息量比单一生育阶段大,更能系统地体现供
试材料在各生育期酶谱的遗传差异性, 使同工酶电泳
技术鉴定的结果更为准确。
3. 4　杂种自然加倍植株及其加倍F 1代抽穗期旗叶的
EST、POD 酶谱中分别呈现 9 和 4 条酶带, 分蘖期幼
叶的 EST、POD、SOD酶谱内分别呈现 8、4和 4条酶
带,其中有多态性位点的特征酶带可作为杂种加倍后
代育性恢复鉴定的遗传标记的候选位点。
参考文献:
[ 1]　于卓, 李造哲, 云锦凤. 几种小麦族禾草及其杂种后代农艺特性
的研究[ J] . 草业学报, 2003, 12( 3) : 83～89
[ 2]　于卓, 云锦凤, 李造哲. 加拿大披碱草和野大麦及其属间杂种细
胞遗传学研究[ A] .见:草业科学进展[ C] . 北京:《草业科学》编辑
部出版, 2002. 33～37
[ 3]　于卓, 云锦凤. 小麦族内几种远缘禾草及其杂交种过氧化物酶同
工酶分析[ J] .中国草地, 1999, 21( 2) : 4～7
[ 4]　何忠效, 张树政. 电泳[ M ] . 北京: 科学出版社, 1999, 281～293
[ 5]　罗广华, 王爱国. 植物 SOD 的凝胶电泳及活性的显示[ J] . 植物
生理学通讯, 1983 ( 6) : 44～45
[ 6]　李昌林, 陈默君, 颜艳. 二色胡枝子品种 SOD、POD 同工酶的酶
谱分析[ J] .草地学报, 2003, 11( 2) : 210～213
[ 7]　李阳春, 谢可军. 早熟禾属 10种植物酯酶同工酶分析[ J] . 草地
学报, 2003, 11( 3) : 214～219
[ 8]　谢可军, 李阳春, 吴天德. 10种早熟禾属植物的过氧化物酶同工
酶分析[ J] .中国草地, 2003, 25( 2) : 30～33
[ 9]　Hazard L, Ghesouiere M . Evidence fr om the use of isozyme
markers of compet it ion in swards between short-leaved and long-
leaved perenn ial r yegrass [ J] . Gras s and For age Science, 1995,
50: 241～248
[ 10] Yamash ita M , Abe J, S himamoto Y. Variat ion and dif ferent ia-
tion of allelic f requencies of is ozyme loci in perennial ryegr as s
( Lolium per enne) [ J ] . Journal of J apanese Society of Grass land
Science, 1993, 38( 4) : 459～468
102 草　地　学　报 第 12卷