全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2003) 01-0058-05
草地早熟禾成熟胚离体培养植株再生技术的研究
佘建明1 , 张保龙1, 陈志一2, 倪万潮1
( 1. 江苏省农业科学院农业生物遣传生理研究所, 南京 210014;
2.浙江绍兴白云建设有限公司,新昌 312500)
摘要: 以大青山草地早熟禾和超级伊克利早熟禾的成熟种子为外植体材料, 研究激动素和生长素及其不同配比组
成的激素组合对愈伤组织诱导发生与生长状态及其绿苗分化能力的影响。结果表明, 在愈伤组织诱导培养基中附
加 2. 0 mg / L 2, 4-D 和0. 2 mg / L BA ,诱导频率在 30%～43%之间。在其继代培养基中添加 1. 0 mg / L 2, 4-D 和0. 5
mg / L BA , 愈伤组织增殖速度快,且保持胚胎发生能力。在愈伤组织分化培养基中附加 2. 0mg/ L BA 或 CPPU ,经
继代培养 3 代的愈伤组织的绿苗分化率保持在 30%左右。在继代培养中,早代选择外表呈干燥、紧密、颗粒状愈伤
组织是克服随着继代培养时间的延长愈伤组织再生植株的能力显著下降这一障碍的简易有效方法。
关键词: 草地早熟禾;成熟种子; 离体培养;愈伤组织; 植株再生
中图分类号: Q813. 1　　　文献标识码 A
A Study on the Technique of Plant Regeneration from Mature Seed
Embryo of Kentucky bluegrass in vitro
SHE Jian-ming
1
, ZHANG Bao-long
1
, CHEN Zhi-yi
2
, NI W an-chao
1
( 1. Inst itute of Agrob iological Genetics an d Phys iology, Jiangsu Academy of Agricul tu ral S ciences, Nanj ing, J ian gsu Province 210014, China;
2. Zhejian g S haoxing Baiyun Const ru ct ion C o. Ltd, Xinchang, Zhejiang Province 312500, C hina)
Abstract: Mature seeds of Poa p ratensi sL. cv. Daqingshan and To tal ecl ipse w er e used for explants. Effect
of hormone composit ions o f differ ent kinds and rat ion on cal lus induct ion, growth state and shoo t regener-
ation was studied. Resul ts indicated that the f requency o f callus induct ion r eached 30%～43% in the callus
induct ion medium supplemented with 2. 0 mg/ L 2, 4-D and 0. 2 mg / L BA . Dur ing subcultures, rapid
gr ow th of callus and embryogenesis w ere maintained in the callus subculture medium plus 1. 0 mg / L 2, 4-D
and 0. 5 mg/ L BA . Af ter callus subcultures, the rate of shoot regener at ion f rom callus w as about 30% in
the dif ferent iat ion medium supplemented w ith 2. 0 mg / L BA or CPPU . Select ing the callus o f dr y, com-
pact , small pellet w as a simple ef fect ive method in early g eneration to overcome the obst ruct ion of plant re-
generat ion.
Key words : Kentucky bluegrass; Poa p r atensis L. ; M ature seed; I n vit ro; Callus; Plant reg eneration
　　草地早熟禾( Poa p r atensis )属冷季型草坪草,
是温带地区重要的草种之一。由于它具有色泽美、抗
寒能力强、耐荫、耐修剪等优点, 在我国北方地区多
被用作建坪草种之一。草地早熟禾亦有自身的缺点,
如易受病虫危害、不耐炎热等。
植物转基因技术的日趋成熟为改良草坪草开辟
了分子生物学育种新途径。成熟胚是适用于植物转
基因研究的理想外植体材料, 迄今为止已有数篇有
关草地早熟禾种子愈伤组织获得再生植株的报
道[ 1～5]。由于草地早熟禾成熟胚的愈伤组织绿苗化
频率偏低, 且愈伤组织经过继代培养后植株再生频
率显著下降[ 4～5] , 甚至完全丧失植株再生的能力 [ 6] ,
收稿日期: 2002-08-22;修回日期: 2002-10-24
作者简介:佘建明( 1945-) ,男,江苏苏州人,大学,研究员,主要从事作物农业生物技术研究,已发表论文 40余篇
第 11卷　第 1期
　Vo l. 11　　No. 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2003 年　3月
March 　2003
从而影响草地早熟禾转基因工作的开展。本试验以
草地早熟禾的成熟种子为试验材料,研究不同外源
激素对愈伤组织诱导发生、愈伤组织绿苗分化和愈
伤组织在继代培养过程中再生植株能力的影响作
用,为开展草地早熟禾转基因工作建立起较高植株
再生频率的受体系统。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
1. 1. 1　大青山草地早熟禾( Poa p ratensi s L. cv.
‘Daqingshan’)由内蒙古畜牧科学院草原研究所孙
海莲同志馈赠; 超级伊克利草地早熟禾 ( Poa
p r atensis L. cv. ‘T otal Ecl ipse’) 由江苏省中国科
学院植物研究所刘建秀研究员提供。
1. 1. 2　以成熟种子为外植体材料。种子先浸泡在
70%乙醇溶液中 1～2 m in, 再转到 0. 1% HgCl2 ,溶
液中消毒 20 min,用无菌水冲洗 3次后接种在培养
基上。
1. 2　培养基
1. 2. 1　基本培养基由 MS 无机盐、B5 维生素组
成[ 7, 8] ,蔗糖 3% ,琼脂条 0. 8%。各种培养基在高压
灭菌前调整 pH 值至 5. 8。
1. 2. 2　愈伤组织诱导培养基, 分别附加由生长素
2, 4-D ( 2, 4-二氯苯氧乙酸 )、Dicamba (麦草畏)、
NAA (萘乙酸)与细胞分裂素 BA ( 6-苄基氨基嘌呤、
CPPU(苯基脲类细胞分裂素)、KT (激动素)配比的
不同激素组合。
1. 2. 3　愈伤组织继代培养基, 分别添加由生长素
2, 4-D、Dicamba、NAA 与细胞分裂素 BA、CPPU、
KT 配比的不同激素组合
1. 2. 4　愈伤组织分化培养基,设置附加细胞分裂素
BA、CPPU 与生长素, 2, 4-D对比组合试验。
1. 2. 5　生根培养基, 添加细胞分裂素 BA、CPPU
与生长素 IBA 配比的激素组合。
1. 3　离体培养方法
种子在愈伤组织诱导培养基上培养 28 d后,将
诱导发生的愈伤组织转移到愈伤组织继代培养基
上。挑选外表呈干燥、紧密、颗粒状愈伤组织在愈伤
组织继代培养基上再连续继代培养 2次,每一代愈
伤组织在新配制的培养上培养 25 d。经继代培养 3
次的愈伤组织转到愈伤组织分化培养基上, 培养 28
d 后统计绿苗分化频率。培养室温度为 26±2℃,光
强 2000 lx ,每日光照 16 h。
2　结果与分析
2. 1　激素对成熟胚诱导愈伤组织的影响
愈伤组织从种子盾片处诱导发生, 有发芽能力
的种子均能诱导产生愈伤组织,不萌动的种子则偶
有愈伤组织发生。在试验前首先检测种子的发芽率。
将种子置于培养皿内滤低上, 在培养室恒温保湿条
件下10 d 后统计发芽率。“大青山草地早熟禾”的发芽
率为33%。“超级伊克利”的发芽率为78%。计算愈伤
组织诱导频率以具有发芽能力的种子数为统计基数。
大青山草地早熟禾和超级伊克利草地早熟禾种子
接种在本试验设计的5种诱导培养基上, 培养12～15
d 后均诱导产生白色、半透明、粘状愈伤组织(图1)。
图 1　种子诱导产生愈伤组织
Fig . 1　Calli induced from mature seeds
　　表 1、2的数据显示, 对生长素而言, 2, 4-D诱导
愈伤组织发生的效果明显优于麦草思( Dicamba ) ,
“超级伊克利”种子在附加麦草思( Dicamba)和 BA
的诱导培养基上,愈伤组织诱导率在 13%～16%之
间, 仅为在添加 2, 4-D和 BA 培养基上的愈伤组织
诱导率的一半左右;对激动素而言, BA 愈伤组织诱
导率最高, CPPU 次之, KT 最低。试验结果表明, 附
加 2, 4-D 2. 0 mg/ L 和 BA 0. 2 mg / L 激素组合的诱
导培养基是诱导草地早熟禾成熟胚愈伤组织发生较为
适宜的培养基,愈伤组织诱导频率达 30%～43%。
59第 1期 佘建明等:草地早熟禾成熟胚离体培养植株再生技术的研究
表 1　激素组合对大青山草地早熟禾成熟胚诱导愈伤组织的影响
Table 1　Effect o f hormone composit ions on callus induction from
matur e seed of Poa p ratensis L . cv . ‘Daqingshan’
激素配比组合( mg/ L)
Hormone composit ion
( mg/ L)
Ⅰ Ⅱ
发芽种子数
No. of
germinat ied s eeds
出愈的种子数
No. of seeds
w ith callus
诱导率( % )
Rate of cal lus
indu ct ion
发芽种子数
No. of
Germinat ied seeds
出愈的种子数
No. of s eeds
w ith callus
诱导率( %)
Rate of cal lus
In duct ion
2, 4-D 2. 0, BA 0. 2 162 63 38. 9 125 54 43. 2
2, 4-D 4. 0, BA 0. 2 120 52 43. 3 113 47 41. 6
Dicamba 7. 0, BA 0. 5 151 41 27. 2 170 52 30. 6
2, 4-D 2. 0, NAA 1. 0, CPPU 0. 5 163 49 30. 1 171 58 33. 9
2, 4-D 2. 0, NAA 1. 0, KT 1. 0 158 40 25. 3 167 47 28. 1
表 2　激素组合对超级伊克利草地早熟禾成熟胚诱导愈伤组织的影响
Table 2　Effect o f hormone composit ions on callus induction from
mat ur e seed o f Poa p ratens is L . cv. ‘T otal eclipse’
激素配比组合( mg/ L)
Hormone composit ion
( mg/ L)
Ⅰ Ⅱ
发芽种子数
No. of
germinat ied s eeds
出愈的种子数
No. of seeds
w ith callus
诱导率( % )
Rate of cal lus
indu ct ion
发芽种子数
No. of
Germinat ied seeds
出愈的种子数
No. of s eeds
w ith callus
诱导率( %)
Rate of cal lus
In duct ion
2, 4-D 2. 0, BA 0. 2 319 96 30. 1 281 91 32. 4
2, 4-D 4. 0, BA 0. 2 295 71 24. 1 366 83 22. 7
Dicamba 7. 0, BA 0. 5 345 57 16. 5 409 54 13. 2
2, 4-D 2. 0, NAA 1. 0, CPPU 0. 5 408 101 24. 8 434 102 23. 5
2, 4-D 2. 0, NAA 1. 0, KT 1. 0 429 70 16. 3 481 89 18. 5
表 3　激素组合对大青山草地早熟禾继代培养愈伤组织生长状态的影响
T able 3　Effect of hormone compositions on ca llus g row th st ate of
Poa p ratensis L . cv . ‘Daqingshan’dur ing ca llus subculture
诱导培养基
Cal lus indu ce medium
继代培养基
Cal lus subcu lture medium
愈伤组织生长状况
Cal lus grow th state
2, 4-D 2. 0, BA 0. 2 2, 4-D 1. 0, BA 0. 5 快速生长,浅黄色。Rapid, lig ht yellow .
2, 4-D 4. 0, BA 0. 2 2, 4-D 1. 0, BA 0. 5 较快生长,浅黄色。Rapider, light yel low .
Dicam ba 7. 0, BA 0. 5 Dicam ba 4. 0, BA 0. 5 缓慢生长,灰白色。Slow , Greyish w hite.
2, 4-D 2. 0, NAA 1. 0,C PPU 0. 5 2, 4-D 1. 0, NAA 0. 5, CPPU 0. 5 快速生长,浅黄色。Rapid, lig ht yellow .
2, 4-D 2. 0, NAA 1. 0,KT 1. 0 2, 4-D 1. 0, NAA 0. 5, KT 0. 5 较快生长,浅黄色。Rapider, light yel low .
表 4　激素组合对超级伊克利草地早熟禾继代培养愈伤组织生长状态的影响
T able 4　Effect of hormone compositions on ca llus g row th st ate of
Poa p ratensis L . cv . ‘To tal eclipse’
诱导培养基
Cal lus indu ce medium
继代培养基
Cal lus subcu lture medium
愈伤组织生长状况
Cal lus grow th state
2, 4-D 2. 0, BA 0. 2 2, 4-D 1. 0, BA 0. 5 快速生长,浅黄色。Rapid, lig ht yellow .
2, 4-D 4. 0, BA 0. 2 2, 4-D 1. 0, BA 0. 5 较快生长,浅黄色。Rapider, light yel low .
Dicam ba 7. 0, BA 0. 5 Dicam ba 4. 0, BA 0. 5 缓慢生长,灰白色。Slow , Greyish w hite.
2, 4-D 2. 0, NAA 1. 0,C PPU 0. 5 2, 4-D 1. 0, NAA 0. 5, CPPU 0. 5 快速生长,浅黄色。Rapid, lig ht yellow .
2, 4-D 2. 0, NAA 1. 0,KT 1. 0 2, 4-D 1. 0, NAA 0. 5, KT 0. 5 较快生长,浅黄色。Rapider, light yel low .
60 草　地　学　报 第 11卷
2. 2　激素对愈伤组织生长状态的影响
2. 2. 1　“大青山草地早熟禾”和“超级伊克利”种子
诱导产生的白色、半透明、粘状愈伤组织分别转移到
与各自相对应的 5种继代培养基上, 培养 15 d 后都
有不同比例的愈伤组织转变成外表呈白色、干燥、紧
密、颗粒状愈伤组织。在第一次继代培养时即能挑选
出少量外表呈浅黄色、干燥、紧密、颗粒状愈伤组织,
在以后的连续继代培养过程中则不会发生逆转,转
移到分化培养基上此类愈伤组织能再生出小植株。
附加 2, 4-D与 BA、CPPU 激素配合的愈伤组织继
代培养基效果尤其突出(表 3、4) ,愈伤组织增殖速
度快,色泽鲜艳(图 2)。
图 2　外表呈干燥、紧密、颗粒状愈伤组织
F ig . 2　Calli of dr y, compact , small pellet
2. 2. 2　与此同时,将这两个品种从 5种不同培养基
中诱导产生的白色、半透明、粘状愈伤组织均转移到
附加 2, 4-D 1. 0 mg/ L 和BA 0. 5 mg / L 的继代培养
基上,笔者观察到随着继代培养时间的延长,愈伤组
织生长状态逐渐趋向于一致的现象。据此认为, 附加
2, 4-D 1. 0 mg / L 和 BA 0. 5 mg/ L 的愈伤组织继代
培养基是草地早熟禾成熟胚愈伤组织继代培养适宜
的培养基。
2. 3　激素对愈伤组织绿苗分化能力的影响
外表呈浅黄色、干燥、紧密、颗粒状愈伤织转到
3种绿苗分化培组养基上,培养 15 d 后均呈现出绿
芽点, 在无 2, 4-D 的分化培养基上进一步分化出绿
苗(图 3) ,而在有 2, 4-D培养基上绿芽点则不能继
续发育成绿苗。绿苗或绿芽点转到生根培养基上培
养均能发育成完整小植株(图 4)。
图 3　愈伤组织分化绿苗
F ig . 3　Shoots r egener ated from ca lli
图 4　再生植株
Fig. 4　The int act plantlets
　　选择外表呈浅黄色、干燥、紧密、颗粒状愈伤组
织, 经连续继代培养 3次后愈伤组织转到分化培养
基上, 两个品种愈伤组织绿苗分化率达 30%左右
(表 5)。
　　白色、粘状愈伤组织在本试验设计的 3种绿苗
分化培养基上仅分化出根系。
3　讨论与结论
3. 1　V an 等 [ 9]认为草地早熟禾组织培养以成熟种
子为外植体材料, 其诱导产生的愈伤组织再生植株
的频率明显比以幼穗为外植体材料偏低。Grif fia
等[ 4]提出在愈伤组织诱导培养基中, dicamba(麦草
畏)和 BA 配合使用比单独使用 2, 4-D、dicamba、pi-
cloram (毒莠定)的效果明显, 在 12个草地早熟禾北
美栽培品种成熟种子诱导产生的愈伤组织中均获
61第 1期 佘建明等:草地早熟禾成熟胚离体培养植株再生技术的研究
表 5　激素对大青山草地早熟禾和超级伊克利草地早熟禾愈伤组织绿苗分化率的影响
Table 5　Effect o f hormone compositions on t he r ate o f shoot r eg ener ation
from callus o f P oa p ratensis L . cv . Daqingshan and T otal eclipse
激素组合( mL / L)
Hormone composit ion( m g/ L)
大青山
P . p ratensi s L . cv.‘Daqin gshan’
超级伊克利
P . p ratensi s L. cv.‘T otal eclips e’
愈伤总数
No. of
total cal lus
绿苗愈伤数
No. of callus
w ith shoot
分化率%
Rate of shoot
regener at ion
愈伤总数
No. of
total cal lus
绿苗愈伤数
No. of callus
w ith shoot
分化率%
Rate of sh oot
regenerat ion
2, 4-D, NAA, BA0. 2 mg/ L 64 0 0 58 0 0
BA 2. 0 mg/ L, NAA 0. 1 mg /L 52 14 26. 9 52 18 30. 6
CPPU 2. 0 mg/ L, NAA 0. 1 mg / L 58 16 27. 6 54 18 36. 0
得再生植株,再生频率在 4%～40%之间。试验结果
表明, 在愈伤组织诱导培养基上附加 2, 4-D 和 BA
的激素组合比 dicamba 和 BA 的组合对“大青山草
地早熟禾”和“超级伊克利”品种的成熟种子诱导愈
伤组织更为适宜;就愈伤组织增殖培养和保持再生
植株的能力而言, 在愈伤组织继代培养基上添加
2, 4-D和 BA 的激素组合的效果比 dicamba 和 BA
的组合更为显著, 经过继代培养 3次,再生植株的频
率达 30%左右。
3. 2　以草地早熟禾种子为外植体诱导产生愈伤组
织,经过增殖培养,然后将愈伤组织转移到分化培养
基上获得再生植株,该技术体系虽早已建立,但长期
保持愈伤组织植株再生能力的关键技术尚未得到解
决。国内外学者都观察到这一现象,即随着草地早熟
禾愈伤组织继代培养时间的延长, 其植株再生的能
力显著下降[ 1, 5] ,超过 3个月愈伤组织丧失植株再生
能力[ 6]。愈伤组织经过长期继代培养能否保持其植
株再生的能力直接影响到草地早熟禾转基因研究工
作的进展。Ke等[ 5]以成熟种子的胚芽鞘为外植体培
养材料,认为植株再生能力与愈伤组织的生长状态
有关,紧密、松散型结构的愈伤组织能再生出健壮植
株。笔者在诱导培养基或在第一次继代培养基选择
出外表呈干燥、紧密、颗粒状愈伤组织,并观察到此
类愈伤组织在以后的继代培养过程中形态上不会发
生逆转现象, 转到分化培养基后愈伤组织仍显示出
具有较高的植株再生能力。通过外源激素的调控可
以长期保持愈伤组织再生植株的能力。在继代培养
过程中,早代选择外表呈干燥、紧密、颗粒状愈伤组
织是克服随着着愈伤组织继代培养时间的延长植株
再生能力显著下降的一种简易、有效的实用方法。
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62 草　地　学　报 第 11卷