全 文 ：第 19 卷 第 2 期
Vol. 19 No. 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2011 年 3 月
M ar. 2011
空间诱变柱花草的 ISSR分析
白昌军1, 2 , 严琳玲1, 2
( 1.中国热带农业科学院作物品种资源研究所,海南 儋州 571737;
2. 农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室, 海南 儋州 571737)
摘要: 采用改良 CT AB 法从空间诱变柱花草( Sty losanthes spp. )嫩叶中提取得到高质量的 DNA,并对柱花草 ISSR
反应体系中的影响因子进行优化,建立柱花草 ISSR 反应的最佳体系。在此基础上, 用 12 条引物对 86 份柱花草进
行遗传多样性分析,结果表明: 共获得 133 条谱带,其中多态性条带数为 109 条, 占总条带数的 81. 95% , 品种中间
的遗传相似系数在 0. 75~ 0. 98,表明其遗传关系比较近。当相似系数在 0. 81 水平时, 可将供试 86 份材料分为 5
大类,其中只有品系 85 号与原对照品种(热研 2 号)聚在一起, 说明大部分空间诱变柱花草株系在 DNA 水平上与
原对照品种存在差异。
关键词: 柱花草; 空间诱变; ISSR-PCR
中图分类号: S541. 9; S335. 2 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2011) 02-0299-07
ISSR Maker Analysis of Stylosanthes spp. Strains by Space Mutation
BAI Chang- jun
1, 2
, YAN Lin- ling
1, 2
( 1. Tropical Crops Genet ic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan Province, 571737, China;
2. M inist ry of Agriculture Key Laboratory for Ut ilization of Tropical Crops Germplasm Resources, Danzhou, Hainan Province, 571737, China)
Abstract: High quality DNA was ex t racted f rom the young leaves of Sty losanthes spp. by improved CTAB
method; The ISSR PCR system suitable for Stylo santhes w as developed af ter test ing influenced facto rs. A
to tal of 133 bands w ere amplif ied by 12 ISSR primers in 86 Sty losanthes spp. accessions, and 109 bands
( 81. 95% ) w ere po lymo rphism . The clustering dendrogram from the analysis w ith NT SYS sof tw are show s
that : the genetic sim ilar ity co ef f icient o f these accessions was 0. 750~ 0. 983, indicating the close genetic
relat ionship of these materials. When similarity coef ficient is set at Dice s coef ficient of 0. 81, the 86
Sty losanthes spp. accessions could be divided into f ive groups. T he r esults show ed that only No. 85 str ain
w as closely related to the o riginal st rain Reyan 2. T his fact suggested that the most o f Sty losanthes spp.
st rains induced by space mutat ion w ould have some difference f rom the original referred ones in DNA
level.
Key words: S ty losanthes spp. ; Space M utat ion; ISSR-PCR r eaction system
柱花草 ( S ty losanthes spp. )是热带、亚热带地
区重要的豆科牧草和饲料植物资源,主要用于草地
良种化改造和林、果草生态工程建设,还在水土流失
治理和退耕还林(草)中发挥重要作用。但由于柱花
草易感染炭疽病,对其产量造成很大影响,因此通过
空间诱变的方式希望能选育综合性状优良的柱花草
新品种(系) ,为南方农区种草养畜提供新的优良品
种,以确保柱花草产业的可持续发展。目前, 空间诱
变柱花草育种研究工作主要从田间观察、形态学、细
胞学、生理生化等方面开展,还没有分子遗传水平的
报道,本研究将利用 ISSR 分子标记来阐明空间诱
变所产生的柱花草 DNA 水平的变异。
简单序列重复区间扩增多态性( ISSR)是由 Z-i
etkiew ics等[ 1]提出的一种锚定简单重复序列( SSR)
的新策略,是建立在 PCR反应基础上的一种新型分
子标记技术。ISSR技术是利用真核生物基因组中
广泛存在的 SSR来设计引物, 以扩增反向排列间隔
不太大的基因组片段。ISSR通常为显性标记, 呈孟
德尔式遗传,具有较好的稳定性和多态性,且具有操
作简单、成本低等特点[ 2] 。由于SSR在真核生物中
收稿日期: 2009-11-03;修回日期: 2010- 12-28
基金项目:国家科技支撑计划( 2008BADB3B08) ;物种资源保护项目;国家重点研究发展计划( 973)项目 ( 2007CB108903)资助
作者简介: 白昌军 ( 1967- ) ,男, 甘肃民勤人, 研究员, 博士, 从事热带牧草种质资源保存、鉴定评价、新品种选育等方面研究, E- mail :
baichangjun 2000@ yahoo. com. cn
草 地 学 报 第 19卷
分布十分普遍且变异速度快, 因而 ISSR标记可检
测到基因组中许多位点的变异 [ 3]。因此, 近年来 IS-
SR技术已被广泛应用于品种鉴定[ 4, 5]、种质资源和
遗传多样性[ 6~ 8]的研究。但目前还未见空间诱变柱
花草 ISSR反应体系构建及其相关的研究报道, 本
研究通过探讨影响 ISSR 反应的多种因素, 建立适
合空间诱变柱花草的 ISSR 反应体系, 为该分子标
记技术应用于空间诱变柱花草新品系选育奠定
基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
将热研 2号柱花草种子利用空间辐射育种技术
于 1996年 10月 20日 11月 4日进行空间诱变处
理,回收种植, 并在幼苗期接种柱花草炭疽病病原
菌,经过多代选择,至 SP5代( 85个品系) , 进行株系
比较试验。试验材料即为此 85 个品系及对照品种
亲本热研 2号( 86号)。
1. 2 试剂
CT AB、Tr is购自生工生物工程(上海)有限公
司, -巯基乙醇、PVP、EDT A、琼脂糖购自 BBI 公
司, 100 bp DNA M arker、200 bp DNA M arker、
DL2000 DNA M arker、6 Loading Buf fer 购自大
连宝生物工程有限公司, 2 T aq PCR Master M ix、
RNase A 购自北京天根生化科技有限公司, T ris 平
衡酚购自天津灏洋生物制品有限公司, Gold View
购自赛百盛, ISSR引物参照 Brit ish Co lumbia 大学
公布的通用引物序列, 由英骏生物技术有限公司合
成,其他生化试剂均为国产分析纯。
1. 3 DNA提取方法
参照严琳玲等 [ 6]的 CT AB改良法。
1. 4 ISSR-PCR反应体系的优化
1. 4. 1 引物及引物退火温度的筛选
随机抽取柱花草 71个品系样品进行引物筛选
及退火温度的确定, 根据 T m 值将所有引物的退火
温度设置为 50 , 53 , 56 , 60 共 4个温度梯度
进行筛选。ISSR 原初的扩增反应条件为15 L
PCR 反应体积,其中包含 7. 5 L T aq m ix, 10 pmo l
L- 1引物 1 L, 50 ng 模板 DNA1 L, 5. 5 L
H 2O;原初扩增程序为: 94 预变性 5 min, 94 变
性 30 s, 50~ 60 退火 1 m in, 72 延伸 2 m in,共 40
个循环; 72 延伸 7 m in, 4 保存。
1. 4. 2 柱花草 ISSR-PCR扩增反应体系的优化
参照 2 T aq PCR Master M ix 的扩增体系,针
对模板 DNA 浓度、引物浓度、2 T aq PCR M aster
M ix 含量 3种因素水平, 按 ISSR-PCR 设计表(表
1)进行单因素 PCR扩增。即当 3因素中一个因子
改变时,其他 2个因素不变,参照原扩增条件中的反
应体系进行。共 15个处理,每个处理重复 2次,柱
花草种质模板DNA 随机抽取71号,引物为 ISSR22
(由 1. 4. 1筛选的引物中随机抽取得到)。反应总体
积为15 L,不足量由灭菌水补足。通过对 PCR扩
增结果的分析, 最终确立适合空间诱变柱花草的
ISSR扩增反应体系。
表 1 用于优化 ISSR-PCR 体系的不同影响因素
T abel 1 Influencing factor s used to optim ize ISSR-PCR system
编号
No.
DNA 浓度
Con cen trat ion of DNA, ng 15 L- 1
引物浓度
Concent rat ion of primer, pmol L- 1
T aq Mix 用量
Amount of Taq M ix,L
1 10 6 2. 5
2 30 8 5
3 50 10 7. 5
4 70 12 10
5 90 14 12. 5
1. 5 ISSR-PCR反应
ISSR-PCR反应体系为 15 L,其中包括: 70 ng
1 L 模板 DNA, 7. 5 L Taq mix, 12 pmo l 1 L 引
物, 5. 5 L H 2O,反应程序为: 94 预变性 5 m in,
94 变性 30 s, 50 ~ 60 退火 1 min, 72 延伸
2 m in,共 40个循环; 72 延伸 7 min, 4 保存。不
同引物退火温度不同。
1. 6 ISSR数据分析
选择清晰且重复性好的条带进行统计分析,一
些较模糊但重复出现的条带也记为有效条带。各样
品在同一位点上扩增片段的有/无分别记为 1/ 0,构
建 0, 1 矩阵。数据处理使用 Excel 和 NTSYSpc
2 02c进行。
300
第 2期 白昌军等:空间诱变柱花草的 ISSR 分析
2 结果与分析
2. 1 DNA样品质量检测
用改良 CTAB法提取的 DNA 呈乳白色, 风干
后无色透明。用 1%琼脂糖凝胶对 DNA 样品进行
电泳检测,结果显示(图 1)跑出的条带清晰,整齐一
致,迁移率较低,无拖带现象, 点样孔中基本没有出
现荧光,说明提出的 DNA 较纯, 蛋白、多糖、酚类等
次生物质去除较干净, 纯度基本达到下游试验的要
求;样品浓度在 240. 5~ 851. 3 g L- 1之间, 说明
通过改良 CTAB法提取的 DNA 纯度较好, 可用于
ISSR分子标记。由此可见,试验采用的改良 CTAB
法适用于柱花草基因组 DNA 的提取。
图 1 部分改良 CTAB法提取的基因组 DNA
F ig . 1 Electropho resis results of to tal DNA by improved CTAB method
Note: M : DL 2000 DNA Ladder Mar ker
2. 2 ISSR-PCR反应体系的优化
2. 2. 1 退火温度的确定
由图 2可知,引物 21~ 30在不同退火温度下跑
出的条带均不一样, 因此,可推断不同的引物由于退
火温度不同而差异较大, 有些引物跑出的条带清晰
且多, 而有些引物则完全跑不出条带。在跑出条带
的引物中,不同温度对其也有影响,例如引物 28中,
退火温度为 50 时有条但有点弥散, 53 , 56 时
的条带都比较清晰, 其中 53 时最清晰, 而 60 时
条带模糊,几乎无条带,因此,可将引物 28的退火温
度设定为 53 ,其他引物以此类推,具体内容如表 2
所示 。
图 2 退火温度对 PCR 扩增结果的影响(引物 21-30)
F ig . 2 Effect o f annealing temperature on PCR amplification w ith primer 21-30
2. 2. 2 模板 DNA 量对 ISSR扩增的影响
通过对模板 DNA 含量的梯度试验发现(图 3
中 1~ 5) , ISSR-PCR 反应对模板 DNA 含量的要求
不是很严格, 范围较大, 10~ 90 ng 的模板含量均能
扩增出条带,但 10~ 50 ng 的模板 DNA 含量扩增出
的条带相对较弱,且条带相对较多;当模板 DNA 含
量达到 90 ng 以上时, 条带略微有点弥散,效果还不
如 70 ng 的 DNA 含量。因此本模板 DNA 最佳含
量为 70 ng。
2. 2. 3 引物浓度对 ISSR扩增的影响
试验中引物含量设置在 6~ 14 pmol L- 1的
范围内(图 3中 6~ 10) ,在含量为 6 pmol L - 1以
301
草 地 学 报 第 19卷
下时,扩增出的条带很弱甚至看不清,在引物含量 8
~ 12 pmo l L - 1的范围内, 扩增条带随着引物含
量增加而变亮, 在 12 pmol L- 1时,亮度相对稳定
清晰度较好,当含量达到 14 pmol L- 1时, 扩增条
带出现弥散。故优化体系选择的引物含量为 12
pmol L- 1。
表 2 退火温度对 PCR 结果的影响
T able 2 Effect of annealing temperatur e on PCR amplificat ion
序号
Number
引物
Prim er
退火温度 Annealing tem perature
50 53 56 60
ISSR1 ( AT ) 8G - - - -
ISSR2 ( AG) 8C + / - - - + +
ISSR3 ( AG) 8G + / - + + + +
ISSR4 ( GA) 8C + / - + - -
ISSR5 ( CT ) 8T + / - - - -
ISSR6 ( CT ) 8G - - - -
ISSR7 ( CA) 8A - + + + +
ISSR8 ( CA) 8G + + + / - + / -
ISSR9 ( GT) 8C + / - - - -
ISSR10 ( T C) 8C + / - - - -
ISSR11 ( TC ) 8G - - - -
ISSR12 ( AC) 8T + / - - - -
ISSR13 ( TG) 8C + / - - - -
ISSR14 ( TG) 8G + + + + / - -
ISSR15 ( AG) 8YT + / - + / - + + +
ISSR16 ( AG) 8YC + + + + + / -
ISSR17 ( GA) 8YT + + + + / - + / -
SSR18 ( GA) 8YC + + + + / - + / -
ISSR19 ( GA) 8YG + / - + / - + / - + +
ISSR20 ( CA) 8RT + + + + / - -
ISSR21 ( CA) 8RC + / - + + + +
ISSR22 ( CA) 8RG + + + + -
ISSR23 ( T C) 8RT + - - -
ISSR24 ( T C) 8RG + - - -
ISSR25 ( AC) 8YT + + + + + / -
ISSR26 ( AC) 8YG + / - + + + + +
ISSR27 ( TG) 8RT + + + + + / -
ISSR28 ( T G) 8RC + / - + + + + / -
ISSR29 ( GGC) 5 + - - -
ISSR30 ( TGC) 5 - - - -
ISSR31 ( AGT ) 5 - - - -
ISSR32 ( TGC) 6 - - - -
ISSR33 ( ACC) 6 - - - -
ISSR34 ( AGC) 6 + / - + / - + / - + +
ISSR35 H BH( AG) 7 + + + + + / -
ISSR36 DVD( T C) 7 + / - + / - + + -
ISSR37 DBD( AC) 7 + / - + / - + + +
ISSR38 HVH ( T G) 7 + / - + + + +
ISSR39 TAG ATC TGA TAT CTG AAT T C C - - - -
ISSR40 CAT GGT GT T GGT CAT T GT T CC A + / - + + + -
注: R = ( A, G) ; Y = ( C, T) ; B = ( C, G, T ) ( i. e. n ot A) ; D = ( A, G, T) ( i. e. not C ) ; H = ( A, C, T) ( i. e. not G) ; V = ( A, C, G)
( i . e. not T ) ; + 表示有扩增产物; + + 表示扩增产物重复性好,带纹清晰; - 表示无扩增产物; + / - 表示扩增产物带谱不稳定
Note: + show s having ampl ified pr odu cts; + + show s amplif ied products w ith repet it ive and dist in ct bands; - show s no amplif icat ion ; + /
- sh ows un steady ampli ficat ion
2. 2. 4 T aq m ix 用量对 ISSR扩增的影响
2 Taq PCR Master M ix 中试剂不仅包含
DNA 聚合酶, dNTPs, M gCl2等 PCR 扩增必需的反
应试剂,同时还含有反应缓冲液、PCR 反应的增强
剂和优化剂以及稳定剂。具有快速、简便、灵敏度
高、特异性强、稳定性好等优点, 且在室温下存放一
302
第 2期 白昌军等:空间诱变柱花草的 ISSR 分析
周,无明显活性改变。本试验采用了加染料(蓝色)
的一种,反应完成后直接电泳。结果表明(图 3 中
11~ 15) , 利用 2 T aq PCR M aster M ix 试剂参与
PCR扩增,不仅能很好的扩增出条带, 稳定性好,而
且减少了 Taq酶、dNT Ps、Mg2+ 分别加入所带来的
不一致性对 PCR结果的影响。
图 3 几种因素对柱花草 ISSR 扩增体系的影响
F ig. 3 Effects of thr ee facto rs on ISSR analy sis in Sty losanthes spp.
由图 3中 11~ 15可知,将 2 T aq PCR Master
Mix 含量设置在 2. 5~ 12. 5 L 的范围内,当含量为
2. 5~ 5 L 时, 扩增条带很弱甚至看不清; 而在 7. 5
L 时, 扩增的条带清晰, 特异性高, 稳定性好; 而当
含量为10~ 12. 5 L 时, 条带呈弥散趋势,出现非特
异性扩增产物。故本试验选用 7. 5 L 的 2 Taq
PCR Master Mix。
2. 3 柱花草的 ISSR-PCR反应
2. 3. 1 柱花草扩增产物的多态性分析
对 86份柱花草进行 ISSR 分析, 从 40对引物
中挑选出 12条扩增条带清晰且具多态性的引物进
行扩增,共得到 133个条带, 大小在 100 ~ 3000 bp
之间,平均每条引物扩增条带数达 11. 08条, 多态性
条带数为 109条,占总条带数的 81. 95%(表 3)。不
同引物扩增出的总带数差异较大,扩增得到条带数
最多的是引物 ISSR17, 为 14条; 而扩增条带数最少
的是引物 ISSR22, 只有 7 条。从扩增多态性条带
看,引物 ISSR2, ISSR3, ISSR36 扩增出的都是多态
性条带, 多态性比例达 100%; 引物 ISSR22 扩增得
到的多态性条带最少,仅 4条,比例仅为 57. 1%。
2. 3. 2 柱花草的 ISSR聚类分析
根据 12 条 ISSR 引物扩增的 133 条谱带, 用
NTSYS 2. 02c 统计软件计算出 86份柱花草种质的
遗传相似系数矩阵, 并进行 UPGMA 聚类分析, 构
建出柱花草遗传关系的树状聚类图(图 5)。86份柱
花草遗传相似系数在 0. 750~ 0. 983, 表明其遗传关
系比较近。由图 5 可知, 当相似系数在 0. 81 水平
时,可将 86份材料分为 5大类,各组具体情况如下:
类群 :品系 18号
类群 :品系 85号, 对照品种 86号
类群:品系 45, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51号
类群:品系 8, 77号
类群:除去类群 ~ 所有品系。
从以上分类后的类群可知, 只有品系 85与原对
照品种热研 2号聚在一起,其他品系都在不同类
群中,说明除了品系 85外的所有品系都与原对照品
种有不同程度上的差异, 进一步证实了空间诱变对
柱花草的有效性。
3 讨论
3. 1 空间诱变柱花草的 ISSR反应
目前运用到空间诱变育种中的分子标记还较
少,主要有 RAPD, AFLP 和 SSR。王斌等 [ 7]将获得
的长荚形突变系和其原始对照品系进行了 RAPD
分析,从图谱中看出突变系之间是一致的,但其与原
始对照品系之间都有着共同差异, 从分子水平上说
明了突变的获得以及突变趋于稳定; 华南农业大学
研究者对空间诱变的水稻 ( Or y z a sat iva )进行了
AFLP 分析,选用的 17对A FLP 选择性引物均能检
测到多态性[ 8] ;易继财等 [ 9]对空间诱变水稻品种特
籼占 13进行 SSR标记, 使用了 299 对引物进行扩
增,有 283对得到了有效扩增产物, 共有 14 对引物
检测出多态性。
试验采用的 ISSR标记结合了 RAPD标记技术
和 SSR标记技术的优点,具有操作简单, 用时少,多
态性高,重复性好,耗资少等优点, 本试验采用了 40
条 ISSR通用引物,其中有 29条获得了有效扩增产
物,共有 12 条检测出多态性。因此,在柱花草空间
诱变育种中用 ISSR标记是可行的。
303
草 地 学 报 第 19卷
图 4 引物 ISSR18的 PCR扩增结果
F ig. 4 PCR profile of pr imers ISSR18
表 3 ISSR引物对 86 份柱花草的扩增位点统计
T able 3 The amplification o f ISSR pr imers on 86 S ty losanthes spp.
引物
Primer
退火温度
T he anneal ing
tem peratu re
总位点数
T he total
Sites
多态性位点数
T he polymorph ic
sites
引物
Primer
退火温度
T he annealing
temperature
总位点数
Th e total
S ites
多态性位点数
T he polymorph ic
sites
ISSR2 60 12 12 IS SR22 50 7 4
ISSR3 60 13 13 IS SR25 56 10 8
ISSR15 60 9 8 IS SR26 53 12 7
ISSR16 53 12 8 IS SR36 56 12 12
ISSR17 53 14 10 IS SR38 60 10 9
ISSR18 53 11 8 IS SR40 56 11 10
3. 2 ISSR-PCR反应体系的优化
ISSR技术是基于 PCR 的一种标记方法, 稳定
性受退火温度、模板 DNA 浓度、引物浓度、Mg2+ 浓
度、T aq DNA聚合酶等因素影响, 本试验针对这些
因子对 ISSR-PCR体系进行了优化。对于引物的退
火温度,从理论上说退火温度高, 特异性强, 但温度
过高, 引物不能与模板 DNA 牢固结合, 扩增效率下
降;温度低,产量高, 但过低会造成引物与模板错配。
而引物浓度也是影响 ISSR 扩增的一个重要因素,
引物含量过低时,与 DNA模板碰撞几率小,结合率
低,扩增产量下降,并有可能出现弥散现象[ 10] ; 而当
引物含量过高时,则会增加错配的机会,产生非特异
性扩增。试验发现退火温度不仅与引物序列有关,
还与物种 DNA 序列有密切关系, 因此试验中将退
火温度的确定与引物的筛选同步进行, 既能减少成
本,又节约时间。
模板 DNA 量是制约扩增产物得率及特异性的
一个重要因子, 模板 DNA含量过低, 分子碰撞的几
率就会下降,偶然性增大,扩增产物就会没有或者不
稳定,容易产生更多条带; 模板 DNA 含量过高, 也
会导致条带增加, 并且容易呈弥散状分布。
T aq DNA 聚合酶, dNT Ps, MgCl2浓度的最佳
比例对于反应体系来说是至关重要的,如在 PCR反
应中, dNTPs 是 PCR 反应原料, 浓度过高容易使
T aq聚合酶产生错配而导致非目的产物产生, 若浓
度过低又会影响 DNA 合成效率; Taq DNA 聚合酶
浓度太高,也会增加非特异性扩增产物,使电泳图谱
背景呈弥散状;浓度太低,则无特异性条带或产物不
稳定[ 11]。Mg 2+ 作为 Taq酶的辅助因子, 不仅影响
T aq酶活性,还能与反应液中的 dNT Ps、模板 DNA
及引物结合, 影响引物与模板的结合效率、模板与
PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚
体的形成[ 12]。而采用 Master Mix 很好地解决了这
个难点,既缩短了试验时间,又能准确地找到稳定的
最优组合,可最大限度地避免 PCR操作中的人为污
染及浪费。
304
第 2期 白昌军等:空间诱变柱花草的 ISSR 分析
图 5 柱花草的 ISSR 聚类图
F ig . 5 Clust ering map of Sty losanthes spp. on ISSR data
3. 3 ISSR-PCR的聚类分析
根据试验构建出的柱花草遗传关系树状聚类图
可知, 86份柱花草遗传相似系数在0. 750~ 0. 983,
表明其遗传关系比较近。当相似系数在 0. 81 水平
时,可将 86 份材料分为 5大类, 具体情况为: 类群
:品系 18; 类群 :品系 85,对照品种 86; 类群:
品系 45, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51; 类群: 品系 8,
77;类群: 除去类群 ~ 的所有品系。其中, 只
有品系 85与原对照品种热研 2号聚在一起,其他
品系都在不同类群中,说明除了品系 85外的所有品
系都与原对照品种有不同程度上的差异, 进一步证
实了空间诱变对柱花草的有效性。在类群中, 第 5
类有 73个品系,说明大部分空间诱变品系的性状都
已趋于稳定,而其他 4个群中的品系都较少, 尤其是
品系 18号单独为一个群,有可能是存在某些变异基
因,有待进一步研究。
参考文献
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(责任编辑 李美娟)
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